Name: immunocytochemical analysis of human pluripotent stem cells using a self-made cytospin apparatus
Uploaded: 2010-04-09T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus at JoVE.com

<p class="jove_content"> Parte de los fondos para este trabajo fue proporcionado por la NSF CARRERA 0744556 (Rao) y una beca a través de la Educación-UCV HHMI Ciencia e Investigación (Pascual). </p>

<p class="jove_title"> Parte 1: La tinción inmunocitoquímica de suspensión </p><ol><li> Las células se recogen en una suspensión de células individuales. </li><li> Las células se transfieren a tubos de microcentrífuga de 1,5 2 ml y se centrifuga a 200 g durante 4 minutos. </li><li> Se lavan las células mediante la aspiración de sobrenadante, se resuspendieron en 1 ml de PBS - (sin Mg <sup>2 +</sup> y Ca <sup>2 +)</sup> y luego se centrifuga de nuevo a 200 g durante 4 minutos. Esto debe hacerse dos veces. </li><li> Después del lavado,...

<ol>
	<li>Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+markers+in+human+embryonic+stem+cells.">Cell surface markers in human embryonic stem cells.</a> <em style='font-style: italic'>Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays</em>. <b>407</b>, 51-61 (2007).</li><li>Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homemade+cytospin+apparatus.">A homemade cytospin apparatus.</a> <em style='font-style: italic'>Anal. Biochem</em>. <b>359</b>, 283-284 (2006).</li></ol>

<p class="jove_content"> A los efectos de nuestro laboratorio, un plato de 35 mm de cultivos de células madre cultivadas en fibroblastos de ratón embrionario (MEFs) es asignado para el procedimiento de tinción inmunohistoquímica para su uso con el aparato cytospin. Las células se recogen por medio de pases enzimática, eliminar la mayor cantidad de la capa de MEF como sea posible, en una suspensión de una sola célula. Si más eficaz de aislamiento de células madre de la capa de MEF se desea, las colonias pueden ser recogidos manualmente...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Lab Tek Permanox Chamber Slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>117437</td>
<td>Material for re-used plastic slides</td>
</tr>
<tr>
<td>Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-550-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1-10&mu;L Filter Tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>1121-3810</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope Cover Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>120542-B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytoseal 280</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Richard-Allan Scientific</td>
<td>8311-4</td>
<td>Mounting Medium</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Goat Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10000C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore/Chemicon</td>
<td>MAB4304</td>
<td>Primary Antibody for SSEA-4 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore/Chemicon</td>
<td>MAB4303</td>
<td>Primary Antibody for SSEA-3 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/ Molecular Probes</td>
<td>A11029</td>
<td>Secondary Antibody for SSEA-4 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/ Molecular Probes</td>
<td>A11006</td>
<td>Secondary Antibody for SSEA-3 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI, Dihydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CalBioChem</td>
<td>268298</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

immunocytochemical analysis of human pluripotent stem cells using a self-made cytospin apparatus

<p class="jove_content">Las células madre pluripotentes (hPSCs) que incluyen células madre embrionarias humanas (hESCs) y las células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs) son una fuente interesante de células debido a su ilimitada capacidad de auto-renovación y su potencial de diferenciarse en múltiples tipos de células. El estado pluripotente de hPSCs se suele evaluar mediante técnicas como la PCR cuantitativa, inmunocitoquímica, y por otros<em&gt; In vitro</em&gt; Y<em&gt; In vivo</em&gt; Estrategias de diferenciación en múltiples tipos de células. Entre ellas, las técnicas de inmunohistoquímica se han desarrollado para la caracterización de rutina del estado indiferenciado de hPSCs basado en el análisis de biomarcadores candidatos intracelular y la superficie celular. Teniendo en cuenta el hecho de que hPSCs crecen como colonias, los problemas surgen en la cuantificación de la expresión de estos marcadores en el nivel de células individuales en forma rutinaria. Análisis de citometría de flujo sirven para solucionar este problema, pero requieren el número de células y el uso de reactivos que normalmente no son propicias para la evaluación de rutina de control de calidad de las culturas hPSC. Por lo tanto, el desarrollo de medios prácticos y reproducible de la creación de muestras monocapa de células con integridad conservado para la evaluación de marcadores tiene muchas ventajas en la investigación con células madre. Esto beneficia en gran medida el análisis inmunocitoquímico, porque las células individuales de la monocapa pueden ser fácilmente observados y cuantificados para la expresión de marcadores específicos. Para lograr este objetivo, un aparato hecho a sí mismo citospina fue construido y optimizado para su uso con la tinción inmunohistoquímica. Dos marcadores de la superficie celular (SSEA3/SSEA4) la expresión se analizaron en una línea de células madre variante BG01 con el propósito de este protocolo.</p>

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Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

<p class="jove_content">Tinción inmunohistoquímica suspensión de las células madre pluripotentes (hPSCs) para los marcadores de la superficie celular (SSEA-3/SSEA-4) se logró basada en el uso de un aparato hecho a sí mismo citospina para crear una monocapa de células para la observación y cuantificación.</p>

Análisis inmunocitoquímico de las células madre pluripotentes utilizando un aparato de Self-Made Cytospin

Human pluripotent stem cells (hPSCs) that include human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are exciting cell ...

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

El análisis de las células madre pluripotentes utilizando criosecciones de cuerpos embrioides

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the ...

Investigación

Biología

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Transfección y Nucleofecting Humanos células madre pluripotentes inducidas

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

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Derivación eficiente de los Derechos Humanos precursores cardiacos y cardiomiocitos de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

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Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

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Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

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Generación rápida y eficiente de las neuronas a partir de células madre pluripotentes en un formato de placa Multititre

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La generación de cardiomiocitos humanos: Protocolo de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas Feeder libres

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Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

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