Name: immunocytochemical analysis of human pluripotent stem cells using a self-made cytospin apparatus
Uploaded: 2010-04-09T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus at JoVE.com

<p class="jove_content"> Delfinansiering för detta arbete har tillhandahållits av NSF i karriären 0744556 (Rao) och ett stipendium genom OAV-HHMI Vetenskaplig utbildning och forskningsprogram (Pascual). </p>

<p class="jove_title"> Del 1: Suspension immuncytokemiska färgning </p><ol><li> Celler skördas i en enda cell suspension. </li><li> Cellerna överförs sedan till 1,5-2ml mikrocentrifugrör och centrifugeras vid 200g i 4 minuter. </li><li> Cellerna tvättas genom att aspirera ut supernatanten resuspenderas i 1 mL PBS - (utan Mg <sup>2 +</sup> och Ca <sup>2 +)</sup> och därefter centrifugeras igen vid 200g i 4 minuter. Detta bör göras två gånger. </li><li> Efter tvätt, celler sedan fastställas av re-avbryta dem i 1 mL 4% paraformaldehyd...

<ol>
	<li>Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+markers+in+human+embryonic+stem+cells.">Cell surface markers in human embryonic stem cells.</a> <em style='font-style: italic'>Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays</em>. <b>407</b>, 51-61 (2007).</li><li>Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homemade+cytospin+apparatus.">A homemade cytospin apparatus.</a> <em style='font-style: italic'>Anal. Biochem</em>. <b>359</b>, 283-284 (2006).</li></ol>

<p class="jove_content"> Vid tillämpning av vårt laboratorium, är en 35mm maträtt av kulturer stamceller som odlas på möss embryonala fibroblaster (MEFs) tilldelas för immuncytokemiska färgningsproceduren för användning med cytospin apparaten. Cellerna är sedan samlas in genom enzymatisk passaging, ta bort så mycket av MEF lager som möjligt i en enda cellsuspension. Om effektivare stamceller isoleras från MEF lagret önskas kan bisamhällena manuellt plockas sedan rötas till suspension. Om mataren fria villkor används i växande...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Lab Tek Permanox Chamber Slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>117437</td>
<td>Material for re-used plastic slides</td>
</tr>
<tr>
<td>Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-550-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1-10&mu;L Filter Tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>1121-3810</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope Cover Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>120542-B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytoseal 280</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Richard-Allan Scientific</td>
<td>8311-4</td>
<td>Mounting Medium</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Goat Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10000C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore/Chemicon</td>
<td>MAB4304</td>
<td>Primary Antibody for SSEA-4 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore/Chemicon</td>
<td>MAB4303</td>
<td>Primary Antibody for SSEA-3 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/ Molecular Probes</td>
<td>A11029</td>
<td>Secondary Antibody for SSEA-4 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/ Molecular Probes</td>
<td>A11006</td>
<td>Secondary Antibody for SSEA-3 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI, Dihydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CalBioChem</td>
<td>268298</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

immunocytochemical analysis of human pluripotent stem cells using a self-made cytospin apparatus

<p class="jove_content">Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) som omfattar mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) är spännande cell källor på grund av deras gränslösa självförnyelse förmåga och sina möjligheter att differentieras till olika celltyper. Den pluripotenta tillstånd hPSCs är normalt bedöms av tekniker såsom qPCR, immuncytokemi, och av andra<em&gt; In vitro</em&gt; Och<em&gt; In vivo</em&gt; Differentiering strategier till flera celltyper. Bland dessa har immuncytokemiska tekniker har utvecklats för rutinmässig karakterisering av den odifferentierade tillstånd hPSCs bygger på analys av kandidat intracellulära och cellytan biomarkörer. Med tanke på att hPSCs växer som kolonier uppstår problem att kvantifiera uttrycket av dessa markörer på individnivå cellnivå på ett rutinmässigt sätt. Flödescytometri analys tjänar till att lösa denna fråga utan kräver cell nummer och användningen av reagens som normalt inte leder till rutinmässig kvalitetskontroll av hPSC kulturer. Därmed har utvecklingen av praktiska och reproducerbar sätt att skapa prover monolager cell med bevarad integritet för markör utvärdering många fördelar inom stamcellsforskningen. Detta gynnar i hög grad immuncytokemiska analysen eftersom enskilda celler från cellslager lätt kan observeras och kvantifieras för uttrycket av specifika markörer. Mot detta mål, var en self-made cytospin apparat konstruerad och optimerad för användning med immuncytokemiska färgning. Två cellytan markörer (SSEA3/SSEA4) uttryck analyserades i en variant BG01 stamceller linje för tillämpningen av detta protokoll.</p>

Watch this Scientific Journal Video about Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus at JoVE.com

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

<p class="jove_content">Avstängning immuncytokemiska färgning av mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) för cellytan markörer (SSEA-3/SSEA-4) uppnåddes baseras på användning av en self-made cytospin apparater för att skapa ett monolager av celler för observation och kvantifiering.</p>

Immuncytokemiska Analys av mänskliga pluripotenta stamceller med hjälp av en self-made Cytospin Apparater

Human pluripotent stem cells (hPSCs) that include human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are exciting cell ...

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

Analys av pluripotenta stamceller genom att använda kryosnitt av Embryoid organ

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfektering och Nucleofecting Human inducerade pluripotenta stamceller

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Derivering av mänskliga Hjärtat prekursorer och Cardiomyocytes från Pluripotenta mänskliga embryonala stamcellslinjer med liten molekyl Induktion

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Omprogrammering Mänskliga somatiska celler in i inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) Använda retroviral vektor med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Generering av Human inducerade pluripotenta stamceller från perifert blod Använda STEMCCA lentivirusvektorn

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Snabb och effektiv generering av nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller i en Multititre Plate format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av Human Cardiomyocytes: differentiering protokoll från Feeder-fria mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion och Analys av Epithelial till mesenkymala övergång

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Human inducerade pluripotenta stamceller från mänskliga somatiska celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Alternativa kulturer för Human pluripotenta stamceller Produktion, underhåll, samt genetisk analys

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...