Name: eukaryotic polyribosome profile analysis
Uploaded: 2010-06-15T17:00:00
Duration: 9 min 16 s
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लेखकों के लिए इस विधि के प्रारंभिक आधार के लिए जॉन Woolford स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं, TGK GM057483 और AI076245 NIH द्वारा समर्थित है और पीआरसी GM77073 द्वारा समर्थित है.

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	<li>Baim, S. B., Pietras, D. F., Eustice, D. C., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+allowing+an+mRNA+secondary+structure+diminishes+translation+of+Saccharomyces+cerevisiae+iso-1-cytochrome+C.">A mutation allowing an mRNA secondary structure diminishes translation of Saccharomyces cerevisiae iso-1-cytochrome C.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 1839-1846 (1985).</li><li>Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRS1+to+DRS7,+novel+genes+required+for+ribosome+assembly+and+function+in+Saccharomyces+cerevisiae.">DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Cell. Biol. 13, 7901-7912 (1993).</li><li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+(eEF)+1A+and+eEF3.">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> J Biol Chem. 278, 6985-6991 (2003).</li><li>Serikawa, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Proteomics. 2, 191-204 (2003).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li><li>Valasek, L., Szamecz, B., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+stabilization+of+preinitiation+complexes+by+formaldehyde+cross-linking.">In vivo stabilization of preinitiation complexes by formaldehyde cross-linking.</a> Methods Enzymol. 429, 163-183 (2007).</li><li>Fletcher, J. E., Copeland, P. R., Driscoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+distribution+of+phospholipid+hydroperoxide+glutathione+peroxidase+mRNA:+evidence+for+a+block+in+elongation+at+the+UGA/selenocysteine+codon.">Polysome distribution of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase mRNA: evidence for a block in elongation at the UGA/selenocysteine codon.</a> Rna. 6, 1573-1584 (2000).</li><li>Ruan, H. J., Brown, C. Y., Morris, D. R., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Analysis of mRNA formation and function. , 305-321 (1997).</li><li>Martin, G. W., Berry, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selenocysteine+codons+decrease+polysome+association+on+endogenous+selenoprotein+mRNAs.">Selenocysteine codons decrease polysome association on endogenous selenoprotein mRNAs.</a> Genes Cells. 6, 121-129 (2001).</li><li>Lee, Y. Y., Cevallos, R. C., Jan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+upstream+open+reading+frame+regulates+translation+of+GADD34+during+cellular+stresses+that+induce+eIF2alpha+phosphorylation.">An upstream open reading frame regulates translation of GADD34 during cellular stresses that induce eIF2alpha phosphorylation.</a> J Biol Chem. 284, 6661-6673 (2009).</li></ol>

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

polyribosome प्रोफ़ाइल से प्राप्त जानकारी सेल के translational स्थिति में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. इसके अलावा, खुद ribosomal सब यूनिटों के विधानसभा की स्थिति 2 निर्धारित किया जा सकता है . उदाहरण के लिए halfmers या 80 और प्रोफ़ाइल पर सही करने के लिए एक मामूली कंधे के साथ बड़े चोटियों की उपस्थिति का संकेत करता है कि एक ही 40S 60 में शामिल होने का इंतजार कर सबयूनिट सबयूनिट. किसी भी जोड़ा cycloheximide या बढ़ाव के अन्य अवरोध करनेवाला के अभाव में प्रयोग प्रदर्शन से चलाने की दर है, जो इंगित करता है चाहे या नहीं बढ़ाव 3 बदल दिया है के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. भिन्न स्वयं एक विशिष्ट mRNA या भिन्न के उत्तरी या पश्चिमी सोख्ता द्वारा प्रोटीन ribosomal subpopulations के साथ सहयोग के बाद निर्धारण के लिए अभिकर्मकों के एक समृद्ध स्रोत रहे हैं. सक्रिय ribosomes के साथ जुड़े mRNAs का कुल पूल जुड़े 4 माइक्रोएरे या गहरी अनुक्रमण 5 विश्लेषण के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है. प्रोटीन संघों भी 6 अभिकर्मक जोड़ने पार के उपयुक्त अलावा द्वारा स्थिर किया जा सकता है . स्तनधारी कोशिकाओं से Polyribosome विश्लेषण भी स्थिर polysomes प्राप्त करने के लिए आवश्यक शर्तों की स्थापना में स्पष्ट कठिनाइयों के संदर्भ में एक अलग प्रोटोकॉल के रूप में उल्लेख के लायक है. साहित्य में रिपोर्ट बफर सिस्टम व्यापक रूप से चर रहे हैं 7-10, इस प्रकार सेल प्रकार lysis बफर के विशिष्ट अनुकूलन के लिए एक आवश्यकता हो सकता है, या यह भी उतना ही सुखद है कि बफर सिस्टम के साथ काम करने के लिए उत्सुक ध्यान के रूप में महत्वपूर्ण नहीं है ताजा lysates कम तापमान पर रखा. हमारे ज्ञान करने के लिए स्तनधारी polysome गठन को प्रभावित करने वाले मापदंडों के एक व्यवस्थित मूल्यांकन रिपोर्ट नहीं किया गया है.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>polyallomer ultracentrifuge tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>326823</td>
<td>1 x 3.5 in. (25x89mm)</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorinert</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F9755</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cycloheximde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C-7698</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H3393</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BY4741</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Open Biosystems</td>
<td>YSC1048</td>
<td>Other strains work equally well</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

eukaryotic polyribosome profile analysis

प्रोटीन संश्लेषण एक जटिल सेलुलर प्रक्रिया है कि कई स्तरों पर विनियमित है है. उदाहरण के लिए, वैश्विक अनुवाद दीक्षा या एमिनो एसिड भुखमरी या वृद्धि कारक वापसी के रूप में सेलुलर तनाव की एक किस्म द्वारा बढ़ाव चरण चरण में हिचकते जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, अलग - अलग mRNAs का अनुवाद mRNA स्थानीयकरण या आत्मीय microRNAs की उपस्थिति द्वारा विनियमित किया जा सकता है है. प्रोटीन संश्लेषण के अध्ययन अक्सर polyribosome विश्लेषण का उपयोग करने के लिए अनुवाद विनियमन या प्रोटीन संश्लेषण में दोषों के तंत्र पर प्रकाश डाला. इस परख में, mRNA / ribosome परिसरों यूकेरियोटिक कोशिकाओं से अलग हैं. एक sucrose के घनत्व ढाल एकाधिक एकल ribosome या monosome करने के लिए बाध्य mRNAs से polyribosomes के रूप में जाना जाता है ribosomes के लिए बाध्य mRNAs को अलग करती है. Gradients के Fractionation अलगाव और अलग ribosomal आबादी और उनके संबद्ध mRNAs या प्रोटीन की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है. Polyribosomes के अनुपात में परिभाषित शर्तों के तहत monosomes करने के लिए अंतर या तो अनुवाद दीक्षा बढ़ाव / या समाप्ति में दोष का संकेत हो सकता है. Polyribosome भागों में मौजूद mRNAs का परीक्षा प्रकट कर सकते हैं कि अलग - अलग mRNAs का काउहोट प्रयोगात्मक शर्तों के साथ परिवर्तन का अनुवाद किया जा रहा है. इसके अलावा, ribosome विधानसभा छोटे और बड़े ribosomal सबयूनिट चोटियों जो भी ढाल के द्वारा अलग कर रहे हैं के विश्लेषण से नजर रखी जा सकता है. इस वीडियो में, हम खमीर कोशिकाओं, निकालने के sucrose ढाल द्वारा जुदाई और परिणामों की व्याख्या से कच्चे ribosomal अर्क की तैयारी के लिए एक तरीका मौजूद है. इस प्रक्रिया को आसानी से स्तनधारी कोशिकाओं के लिए अनुकूलनीय है.

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Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

इस लेख यूकेरियोटिक कोशिकाओं से ribosomes अनुवाद की निकासी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. एक बार निकाले ribosomes monosomes और polyribosomes में sucrose ढाल fractionation द्वारा अलग अलग ribosomal आबादी का विश्लेषण किया जा करने की अनुमति. जैसे, इस विधि के अनुवाद के नियमन की जांच के लिए सोने के मानक है.

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