Name: quantification of &gamma;h2ax foci in response to ionising radiation
Uploaded: 2010-04-06T19:35:00
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Die Unterstützung des Australian Institute of Nuclear Science and Engineering anerkannt wird. TCK war der Empfänger der AINSE Auszeichnungen. Epigenomischen Medicine Lab wird von der National Health and Medical Research Council of Australia (566559) unterstützt. LM wird von Melbourne Research (University of Melbourne) und Biomedical Imaging CRC zusätzliche Stipendien unterstützt. Die Unterstützung der Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody und Iska Carmichael) war von unschätzbarem Wert für diese Arbeit.

<html> Cell Preparation <ol><li> Menschliche Keratinozyten (FEP-1811) wurden in Keratinozyten-Serum-freiem Medium gewachsen (K-SFM; Invitrogen), ergänzt mit epidermal growth factor-, Rinder-Hypophysen-Extrakt und 20 pg / ml Gentamicin, bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Eine einzelne Zelle Suspension wurde durch Ablösen mit Trypsin-EDTA (0,05% v / v) vorbereitet </li><li> Die Zellen wurden in 8-Well-Lab Tek II Mikrokammer Objektträger ausgesät (10.000 Zellen / well) und Dias wurden für 3 Tage bei 37 ° ...

<ol>
	<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li><li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma+H2AX+and+cancer.">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li><li>Savic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Dynamic+[gamma]-H2AX+Domains+along+Broken+DNA+Strands+Is+Distinctly+Regulated+by+ATM+and+MDC1+and+Dependent+upon+H2AX+Densities+in+Chromatin.">Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin.</a> Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).</li><li>Downs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+chromatin-modifying+activities+to+phosphorylated+histone+H2A+at+DNA+damage+sites.">Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites.</a> Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).</li><li>Chowdhury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[gamma]-H2AX+Dephosphorylation+by+Protein+Phosphatase+2A+Facilitates+DNA+Double-Strand+Break+Repair.">[gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair.</a> Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).</li><li>Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PP4+is+a+gamma+H2AX+phosphatase+required+for+recovery+from+the+DNA+damage+checkpoint.">PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint.</a> EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).</li><li>Altaf, M., Auger, A., Covic, M., C&#244;t&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connection+between+histone+H2A+variants+and+chromatin+remodeling+complexes.">Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes.</a> Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).</li><li>Kusch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+by+Tip60+Is+Required+for+Selective+Histone+Variant+Exchange+at+DNA+Lesions.">Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions.</a> Science. 306, 2084-2087 (2004).</li><li>Hurlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype.">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).</li><li>Dickey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+functional+roles+and+potential+applications.">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. , (2009).</li></ol>

Nach Exposition gegenüber ionisierender Strahlung (γ-Strahlen), γH2AX Brennpunkte bilden sich rasch und Schwerpunkte Zahlen erreichen ein Maximum zwischen 30-60 Minuten 2. Daher spiegelt unsere 1 Stunde nach der Bestrahlung Zeitpunkt anfänglichen DSB Bildung. Wir haben die klinisch relevante Strahlendosis von 2 Gy für unser Experiment verwendet. Allerdings kann das Verfahren zur Strahlendosis eingesetzt werden bis zu 4 Gy für den Nachweis von anfänglichen DSB Bildung; erhebliche Überschneidungen der H...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM)</td>
<td>Media</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17005042</td>
<td>Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE).</td>
</tr>
<tr>
<td>Lab Tek lI Chamber Slides (8-well)</td>
<td>Chamber Slides</td>
<td>Nunc Denmark</td>
<td>NUN154534</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (22x50mm)</td>
<td>Coverslips</td>
<td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
<td>CS2250100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7906</td>
<td>BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17-517Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5% Trypsin-EDTA x10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15400-054</td>
<td>Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>158127</td>
<td>Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody</td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Millipore</td>
<td>16193</td>
<td>Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11029</td>
<td>Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>TOPRO3</td>
<td>DNA Stain</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T3605</td>
<td>DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser.</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold</td>
<td>Anti-fade solution</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>Refractive index of 1.42 at 20&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tissue Culture Flask, Vented Cap</td>
<td>Culture Flask</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353112</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Culture Dish (150x25mm)</td>
<td>Petridish</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coplin Jar, glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>1771-OG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Trough</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>V1991.99</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gammacell 1000 Elite Irradiator</td>
<td>Gamma Irradiator</td>
<td>Nordion International Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Metamorph</td>
<td>Software for Imaging analysis</td>
<td>Molecular Devices, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

quantification of &gamma;h2ax foci in response to ionising radiation

DNA-Doppelstrangbrüche (DSB), die entweder durch endogene Stoffwechselprozesse oder durch exogene Quellen hervorgerufen werden, sind eines der wichtigsten DNA-Schäden in Bezug auf das Überleben und die Erhaltung der genomischen Integrität. Eine frühe Reaktion auf die Induktion von DSB ist die Phosphorylierung des H2A Histon-Variante H2AX, bei der Serin-139-Rest, in der hoch konservierten C-terminalen SQEY Motiv bilden γH2AX<sup&gt; 1</sup&gt;. Nach Induktion von DSB ist H2AX schnell durch die Phosphatidyl-inosito-3-Kinase (PIKK) Familie von Proteinen, Ataxie Teleangiektasien mutiert (ATM), DNA-Protein-Kinase-katalytischen Untereinheit und ATM und Rad3 Zusammenhang phosphoryliert (ATR)<sup&gt; 2</sup&gt;. In der Regel sind nur wenige Basenpaare (bp) in einer DSB beteiligt, gibt es jedoch erhebliche Signalverstärkung, angesichts der Bedeutung des Chromatin-Modifikationen in der DNA-Schäden Signalisierung und zu reparieren. Die Phosphorylierung von H2AX vermittelt überwiegend von ATM-Spreads zu den angrenzenden Gebieten von Chromatin, die bei etwa 0,03% des gesamten zellulären H2AX pro DSB<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Dies entspricht Phosphorylierung von etwa 2000 H2AX Moleküle Spanning ~ 2 Mbp Regionen des Chromatins um das Gelände des DSB und führt zur Bildung von diskreten γH2AX Herde, die leicht sichtbar gemacht und quantifiziert durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie kann<sup&gt; 2</sup&gt;. Der Verlust von γH2AX bei DSB spiegelt reparieren, jedoch gibt es einige Kontroversen darüber, was definiert komplette Reparatur von DSB, es wurde vorgeschlagen, dass Wiedereintritt der beiden DNA-Stränge ausreichend ist jedoch, wurde auch vorgeschlagen, dass Wiedereinsetzung des Original Chromatin Zustand der Verdichtung ist notwendig,<sup&gt; 4-8</sup&gt;. Das Verschwinden der γH2AX beinhaltet zumindest teilweise, Dephosphorylierung durch Phosphatasen, Phosphatase 2A und Phosphatase 4C<sup&gt; 5,6</sup&gt;. Darüber hinaus hat die Entfernung des γH2AX durch Umverteilung mit Histon-Austausch mit H2A.Z verwickelt<sup&gt; 7,8</sup&gt;. Wichtig ist, dass die quantitative Analyse der γH2AX Schwerpunkte, die eine breite Palette von Anwendungen in der Medizintechnik und der kerntechnischen Forschung geführt. Hier zeigen wir die am häufigsten verwendeten Immunfluoreszenz-Methode für die Bewertung der ersten DNA-Schäden durch den Nachweis und die Quantifizierung der γH2AX Brennpunkte in γ-bestrahlten adhärenten humanen Keratinozyten<sup&gt; 9</sup&gt;.

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Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Die Quantifizierung der DNA-Doppelstrang Streifen mit γH2AX Bildung als einen molekularen Marker hat sich zu einem wertvollen Werkzeug in der Strahlenbiologie. Hier zeigen wir die Verwendung eines Immunfluoreszenztest zur Quantifizierung von γH2AX Foci nach Exposition von Zellen gegenüber Strahlung.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Gewebeproben

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Forschung

Biologie

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

Auswertung der räumlichen Verteilung der γH2AX folgenden ionisierender Strahlung

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polarized Translokation von fluoreszierenden Proteinen in Xenopus Ektoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Zwei-und dreidimensionale Live Cell Imaging der DNA-Reparatur-Proteine

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Mess Glutathion-induzierte Fütterung Antwort in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Untersuchung von Proteinen, entstehende DNA in Säugerzellen Bound Mit BrdU-chip-Slot-westliche Technik

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots Gewebespezifische Zellwand Änderungen überwachen

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Methoden zur Klassifizierung von zytoplasmatischen Foci als Säugetier-Stressgranulat

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Regeneration des Darmepithels als Reaktion auf ionisierende Bestrahlung

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration via Decellularization

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration (Video) | JoVE 

Dezellularisierungsbasierte Quantifizierung der Fettinfiltration der Skelettmuskulatur

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic ...