Name: quantification of &gamma;h2ax foci in response to ionising radiation
Uploaded: 2010-04-06T19:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of ÃŽÂ³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation at JoVE.com

परमाणु विज्ञान और इंजीनियरिंग के ऑस्ट्रेलियाई संस्थान का समर्थन स्वीकार किया है. TCK AINSE पुरस्कार के प्राप्तकर्ता था. Epigenomic चिकित्सा लैब राष्ट्रीय स्वास्थ्य और ऑस्ट्रेलिया के चिकित्सा अनुसंधान परिषद (566,559) द्वारा समर्थित है. LM मेलबोर्न (मेलबोर्न विश्वविद्यालय) अनुसंधान और बायोमेडिकल इमेजिंग सीआरसी अनुपूरक छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित है. मोनाश माइक्रो इमेजिंग के समर्थन (डीआरएस स्टीफन कोड़ी और Iśka Carmichael) इस काम के लिए अमूल्य था.

<html> सेल तैयार <ol><li> Keratinocyte सीरम मुफ्त मध्यम में मानव keratinocytes (FEP-1811) बड़े हो रहे थे (कश्मीर SFM, Invitrogen) epidermal वृद्धि कारक, गोजातीय पिट्यूटरी निकालने और 20 μg / मिलीलीटर gentamicin के साथ पूरक 37 में डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 . </li><li> ए...

<ol>
	<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li><li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma+H2AX+and+cancer.">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li><li>Savic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Dynamic+[gamma]-H2AX+Domains+along+Broken+DNA+Strands+Is+Distinctly+Regulated+by+ATM+and+MDC1+and+Dependent+upon+H2AX+Densities+in+Chromatin.">Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin.</a> Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).</li><li>Downs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+chromatin-modifying+activities+to+phosphorylated+histone+H2A+at+DNA+damage+sites.">Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites.</a> Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).</li><li>Chowdhury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[gamma]-H2AX+Dephosphorylation+by+Protein+Phosphatase+2A+Facilitates+DNA+Double-Strand+Break+Repair.">[gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair.</a> Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).</li><li>Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PP4+is+a+gamma+H2AX+phosphatase+required+for+recovery+from+the+DNA+damage+checkpoint.">PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint.</a> EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).</li><li>Altaf, M., Auger, A., Covic, M., C&#244;t&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connection+between+histone+H2A+variants+and+chromatin+remodeling+complexes.">Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes.</a> Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).</li><li>Kusch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+by+Tip60+Is+Required+for+Selective+Histone+Variant+Exchange+at+DNA+Lesions.">Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions.</a> Science. 306, 2084-2087 (2004).</li><li>Hurlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype.">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).</li><li>Dickey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+functional+roles+and+potential+applications.">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. , (2009).</li></ol>

Ionizing विकिरण (γ रे), γH2AX foci तेजी फार्म और foci संख्या के बाद जोखिम 3-60 2 मिनट के बीच एक अधिकतम तक पहुँचने. इसलिए, हमारे 1 घंटे के समय के बाद विकिरण बिंदु प्रारंभिक DSB गठन को दर्शाता है. हम अपने प्रयोग के लिए नैदानिक ?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM)</td>
<td>Media</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17005042</td>
<td>Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE).</td>
</tr>
<tr>
<td>Lab Tek lI Chamber Slides (8-well)</td>
<td>Chamber Slides</td>
<td>Nunc Denmark</td>
<td>NUN154534</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (22x50mm)</td>
<td>Coverslips</td>
<td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
<td>CS2250100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7906</td>
<td>BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17-517Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5% Trypsin-EDTA x10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15400-054</td>
<td>Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>158127</td>
<td>Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody</td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Millipore</td>
<td>16193</td>
<td>Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11029</td>
<td>Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>TOPRO3</td>
<td>DNA Stain</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T3605</td>
<td>DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser.</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold</td>
<td>Anti-fade solution</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>Refractive index of 1.42 at 20&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tissue Culture Flask, Vented Cap</td>
<td>Culture Flask</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353112</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Culture Dish (150x25mm)</td>
<td>Petridish</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coplin Jar, glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>1771-OG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Trough</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>V1991.99</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gammacell 1000 Elite Irradiator</td>
<td>Gamma Irradiator</td>
<td>Nordion International Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Metamorph</td>
<td>Software for Imaging analysis</td>
<td>Molecular Devices, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

quantification of &gamma;h2ax foci in response to ionising radiation

डीएनए डबल भूग्रस्त (DSBs) टूट जाता है, जो या तो अंतर्जात चयापचय प्रक्रियाओं के द्वारा या exogenous स्रोतों द्वारा प्रेरित कर रहे हैं और जीनोमिक अखंडता के अस्तित्व के संरक्षण के लिए सम्मान के साथ एक सबसे महत्वपूर्ण डीएनए घावों के कर रहे हैं. DSBs की प्रेरण के लिए एक प्रारंभिक प्रतिक्रिया H2A histone संस्करण, H2AX की phosphorylation सेरीन-139 अवशेषों पर, उच्च संरक्षित सी टर्मिनल SQEY आकृति में, बनाने γH2AX<sup&gt; 1</sup&gt;. DSBs की प्रेरण के बाद, H2AX तेजी से 3-kinase phosphatidyl - inosito (PIKK) प्रोटीन के परिवार, गतिभंग telangiectasia उत्परिवर्तित (एटीएम), डीएनए प्रोटीन kinase उत्प्रेरक सबयूनिट और एटीएम और RAD3 से संबंधित द्वारा phosphorylated है (एटीआर)<sup2&gt;</sup&gt;. आमतौर पर, केवल कुछ बेस जोड़े (बीपी) के एक DSB में फंसा रहे हैं डीएनए की क्षति संकेतन और मरम्मत में chromatin संशोधन के महत्व को देखते हुए, तथापि, वहाँ महत्वपूर्ण संकेत प्रवर्धन है,. H2AX की phosphorylation chromatin के आसन्न क्षेत्रों के लिए एटीएम फैलता द्वारा मुख्य रूप से मध्यस्थता, DSB अनुसार कुल सेलुलर H2AX के लगभग 0.03% को प्रभावित<sup2,3&gt;</sup&gt;. यह लगभग 2000 H2AX ~ 2 chromatin की MBP DSB और असतत γH2AX foci के गठन में परिणाम की साइट है जो आसानी से कल्पना और immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा quantitated किया जा सकता है आसपास के क्षेत्रों में फैले अणुओं की phosphorylation से मेल खाती है है<sup2&gt;</sup&gt;. DSB पर γH2AX के नुकसान की मरम्मत को दर्शाता है, तथापि, वहाँ क्या DSBs की पूरी मरम्मत परिभाषित करने के रूप में कुछ विवाद है, यह प्रस्ताव किया गया है कि डीएनए के दोनों किस्में के फिर से शामिल पर्याप्त तथापि, यह भी सुझाव दिया गया है कि पुनः - instatement संघनन की मूल chromatin राज्य आवश्यक है<sup&gt; 4-8</sup&gt;. γH2AX के disappearence कम से कम हिस्से में शामिल है, phosphatases, फॉस्फेट 2A और फॉस्फेट 4C द्वारा dephosphorylation<sup5,6&gt;</sup&gt;. इसके अलावा, γH2AX के पुनर्वितरण के द्वारा हटाने H2A.Z साथ histone विनिमय शामिल फंसाया गया है<sup7,8&gt;</sup&gt;. महत्वपूर्ण बात, γH2AX foci के मात्रात्मक विश्लेषण चिकित्सा और परमाणु अनुसंधान के क्षेत्र में आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए नेतृत्व किया गया है. यहाँ, हम γ विकिरणित पक्षपाती मानव keratinocytes में पता लगाने और γH2AX foci के quantitation द्वारा प्रारंभिक डीएनए की क्षति के मूल्यांकन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया immunofluorescence विधि का प्रदर्शन<sup9&gt;</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of ÃŽÂ³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation at JoVE.com

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

डीएनए डबल भूग्रस्त एक आणविक मार्कर के रूप में γH2AX गठन का उपयोग धारियाँ की मात्रा का ठहराव विकिरण जीव विज्ञान में एक अमूल्य उपकरण बन गया है. यहाँ हम γH2AX foci के विकिरण के कक्षों के प्रदर्शन के बाद मात्रा का ठहराव के लिए एक immunofluorescence परख के उपयोग के प्रदर्शन.

ΓH2AX foci के Ionising विकिरण करने के लिए प्रत्युत्तर में मात्रा का ठहराव

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

ΓH2AX foci के ऊतकों के नमूनों में quantitation

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

विकिरण के बाद γH2AX के स्थानिक वितरण का मूल्यांकन

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

फ्लोरोसेंट प्रोटीन के Polarized में स्थानान्तरण Xenopus WNT सिगनल उत्तर में बाह्य त्वक स्तर

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

दो और तीन आयामी डीएनए क्षति प्रतिक्रिया प्रोटीन की लाइव सेल इमेजिंग

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

हाइड्रा में glutathione प्रेरित दूध पिलाने की प्रतिक्रिया को मापने

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

स्तनधारी कोशिकाओं में नवजात डीएनए के लिए बाध्य प्रोटीन की परीक्षा BrdU चिप-खांचा-पश्चिमी तकनीक का प्रयोग

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

में क्रिस्टलीय सेलूलोज़ संचय के उच्च संकल्प मात्रा<em&gt; Arabidopsis</em&gt; जड़ें ऊतक विशेष सेल की दीवार संशोधनों नजर रखने के लिए

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

स्तनधारी तनाव ग्रॅन्यूलस के रूप में साइकोस्लैस्मीनिक फॉस्ट को वर्गीकृत करने के तरीके

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

आयनीकरण विकिरण के जवाब में आंतों के उपकला पुनर्जनन

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration via Decellularization

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration (Video) | JoVE 

कंकाल की मांसपेशी फैटी घुसपैठ का विकोशिकीयकरण-आधारित परिमाणीकरण

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic ...