Name: in situ subcellular fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells
Uploaded: 2010-07-23T17:30:00
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Anyaporn Sawasdichai et Nazefah Abdul Hamid sommes reconnaissants envers le gouvernement royal thaïlandais et le Gouvernement de la Malaisie, respectivement, pour un doctorat Bourses. Ce travail a été financé par une subvention du Wellcome Trust de projet attribué à PSJ et KG. Nous sommes également reconnaissants à l&#39;Université de Bristol Facilité Bioimaging Wolfson.

I. Préparation pour le fractionnement Cette section décrit la préparation de poly-L-Lysine lamelles de microscope enduit et la fixation des cellules avant de fractionnement. Si nécessaire, les cellules peuvent être transitoirement transfectées avec des vecteurs d&#39;expression de protéines avant ou après la fixation. A. Préparation de poly-L-Lysine lamelles revêtement <ol><li> Préparer une solution de 1mg/ml poly-L-lysine dans l&#39;eau distillée. </...

<ol>
	<li>Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopBP1+regulates+human+papillomavirus+type+16+E2+interaction+with+chromatin.">TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin.</a> J Virol. 81, 4338-4342 (2007).</li><li>Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Groucho/TLE/R-esp+proteins+associate+with+the+nuclear+matrix+and+repress+RUNX+(CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha))+dependent+activation+of+tissue-specific+gene+transcription.">Groucho/TLE/R-esp proteins associate with the nuclear matrix and repress RUNX (CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha)) dependent activation of tissue-specific gene transcription.</a> J Cell Sci. 113, 2221-2231 (2000).</li><li>Kowalczyk, A. M., Roeder, G. E., Green, K., Stephens, D. J., Gaston, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+induction+or+inhibition+of+apoptosis+by+HPV+proteins.">Measuring the induction or inhibition of apoptosis by HPV proteins.</a> Methods Mol. Med. 119, 419-432 (2005).</li><li>McLarren, K. W., Theriault, F. M., Stifani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+with+the+nuclear+matrix+and+interaction+with+Groucho+and+RUNX+proteins+regulate+the+transcription+repression+activity+of+the+basic+helix+loop+helix+factor+Hes1.">Association with the nuclear matrix and interaction with Groucho and RUNX proteins regulate the transcription repression activity of the basic helix loop helix factor Hes1.</a> J Biol. Chem. 276, 1578-1584 (2001).</li><li>McNeil, S., Guo, B., Stein, J. L., Lian, J. B., Bushmeyer, S., Seto, E., Atchison, M. L., Penman, S., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+the+YY1+transcription+factor+to+the+nucleolus+and+the+nuclear+matrix+in+situ:+the+C-terminus+is+a+principal+determinant+for+nuclear+trafficking.">Targeting of the YY1 transcription factor to the nucleolus and the nuclear matrix in situ: the C-terminus is a principal determinant for nuclear trafficking.</a> J Cell Biochem. 68, 500-510 (1998).</li><li>Melan, M. A., Sluder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redistribution+and+differential+extraction+of+soluble+proteins+in+permeabilized+cultured+cells.+Implications+for+immunofluorescence+microscopy.">Redistribution and differential extraction of soluble proteins in permeabilized cultured cells. Implications for immunofluorescence microscopy.</a> J Cell Sci. 101, 731-743 (1992).</li><li>Zou, N., Lin, B. Y., Duan, F., Lee, K. Y., Jin, G., Guan, R., Yao, G., Lefkowitz, E. J., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hinge+of+the+human+papillomavirus+type+11+E2+protein+contains+major+determinants+for+nuclear+localization+and+nuclear+matrix+association.">The hinge of the human papillomavirus type 11 E2 protein contains major determinants for nuclear localization and nuclear matrix association.</a> J. Virol. 74, 3761-3770 (2000).</li></ol>

Les problèmes courants et suggestions: Tous ou la plupart des cellules sont perdues pendant le lavage. Pendant les étapes liquides de lavage doit être ajouté lentement sur le côté de la plaque de 6 puits en évitant la lamelle. De même les liquides doivent être enlevés par attentivement inclinant la plaque et lentement pipetage hors excès de liquide. L&#39;adhésion cellulaire peut être augmentée en utilisant la poly-L-Lysine lamelles enrobées. L&#39;AD...

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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BSA</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9647-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNase I</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>DN25-1G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>poly-L-Lysine</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-8920</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>Chemical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EGTA</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>E4378-25G </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fomaldehyde</td>
<td>Chemical</td>
<td>BDH</td>
<td>284216N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PIPES</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-6757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>Chemical</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>S/8600/53</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>T-6876</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mounting Medium with DAPI</td>
<td>Chemical</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fugene 6 Transfection Reagent</td>
<td>Chemical</td>
<td>Roche </td>
<td>11814443001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histone H1</td>
<td>Antibodies</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-8030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lamin A/C</td>
<td>Antibodies</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-20681</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubulin-&alpha;</td>
<td>Antibodies</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-32293</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in situ subcellular fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells

La fonction des protéines est intimement couplée à la localisation des protéines. Bien que certaines protéines sont limités à un endroit précis ou un compartiment subcellulaire, de nombreuses protéines sont présentes en tant que population librement diffusant dans le libre-échange avec une sous-population qui est étroitement associé à un domaine particulier ou d&#39;une structure subcellulaire. En fractionnement subcellulaire in situ permet la visualisation de compartimentation de protéines et peut aussi révéler des protéines sous-populations qui localisent à des structures spécifiques. Par exemple, la suppression des protéines solubles dans le cytoplasme et lâchement protéines nucléaires peut révéler l&#39;association stable de certains facteurs de transcription à la chromatine. Après la digestion de l&#39;ADN peut dans certains cas révéler association avec le réseau de protéines et d&#39;ARN qui est collectivement appelés le nucléaire échafaudage ou de la matrice nucléaire. Nous décrivons ici les étapes nécessaires au cours des fractionnement in situ de adhérentes et cellules non adhérentes de mammifères sur des lamelles de microscope. La visualisation des protéines peut être réalisée en utilisant des anticorps spécifiques ou des protéines de fusion fluorescentes et la microscopie à fluorescence. Les anticorps et / ou des colorants fluorescents qui agissent comme des marqueurs pour les compartiments spécifiques ou des structures permettant la localisation des protéines à être cartographié en détail. En fractionnement in situ peut également être combiné avec Western blot pour comparer les quantités de protéines présentes dans chaque fraction. Cette approche simple biochimiques peuvent révéler des associations qui seraient autrement inaperçus.

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In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

En fractionnement subcellulaire in situ des cellules de mammifères sur des lamelles de microscope permet la visualisation de la localisation des protéines.

En fractionnement subcellulaire situ des adhérentes et non-adhérents des cellules de mammifères

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Research

JoVE Journal

Biology

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

Trypsinisation et Repiquage des cellules de mammifères

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Recherche

Biologie

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

EsiRNA MISSION pour le dépistage de l&#39;ARNi dans les cellules de mammifères

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Test clonogénique: cellules adhérentes

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analyse de la situation du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères

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Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Polysome Fractionnement et analyse des mammifères Translatomes sur une échelle de l&#39;ensemble du génome

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Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Mesure des niveaux Heme synthèse dans des cellules de mammifères

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imagerie Ca locale<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaux de cellules de mammifères cultivées

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Coloration immunofluorescente in situ de l&#39;autophagie dans les cellules souches musculaires

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

État fondamental l’appauvrissement Super-résolution imagerie dans les cellules de mammifères

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...