Name: in situ subcellular fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells
Uploaded: 2010-07-23T17:30:00
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Anyaporn Sawasdichai और Nazefah अब्दुल हमीद रायल थाई सरकार और मलेशिया सरकार के लिए आभारी क्रमशः पीएच.डी. के लिए छात्रवृत्ति. यह काम एक वेलकम ट्रस्ट परियोजना PSJ और केजी के लिए सम्मानित किया अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था. हम भी हैं के ब्रिस्टल वोल्फसन Bioimaging सुविधा के विश्वविद्यालय के लिए आभारी हैं.

Fractionation के लिए मैं तैयार यह खंड पाली एल Lysine लेपित खुर्दबीन coverslips और fractionation के लिए पहले कोशिकाओं की कुर्की की तैयारी का वर्णन करता है. यदि आवश्यक कोशिकाओं प्रोटीन अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ transiently जा सकत?...

<ol>
	<li>Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopBP1+regulates+human+papillomavirus+type+16+E2+interaction+with+chromatin.">TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin.</a> J Virol. 81, 4338-4342 (2007).</li><li>Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Groucho/TLE/R-esp+proteins+associate+with+the+nuclear+matrix+and+repress+RUNX+(CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha))+dependent+activation+of+tissue-specific+gene+transcription.">Groucho/TLE/R-esp proteins associate with the nuclear matrix and repress RUNX (CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha)) dependent activation of tissue-specific gene transcription.</a> J Cell Sci. 113, 2221-2231 (2000).</li><li>Kowalczyk, A. M., Roeder, G. E., Green, K., Stephens, D. J., Gaston, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+induction+or+inhibition+of+apoptosis+by+HPV+proteins.">Measuring the induction or inhibition of apoptosis by HPV proteins.</a> Methods Mol. Med. 119, 419-432 (2005).</li><li>McLarren, K. W., Theriault, F. M., Stifani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+with+the+nuclear+matrix+and+interaction+with+Groucho+and+RUNX+proteins+regulate+the+transcription+repression+activity+of+the+basic+helix+loop+helix+factor+Hes1.">Association with the nuclear matrix and interaction with Groucho and RUNX proteins regulate the transcription repression activity of the basic helix loop helix factor Hes1.</a> J Biol. Chem. 276, 1578-1584 (2001).</li><li>McNeil, S., Guo, B., Stein, J. L., Lian, J. B., Bushmeyer, S., Seto, E., Atchison, M. L., Penman, S., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+the+YY1+transcription+factor+to+the+nucleolus+and+the+nuclear+matrix+in+situ:+the+C-terminus+is+a+principal+determinant+for+nuclear+trafficking.">Targeting of the YY1 transcription factor to the nucleolus and the nuclear matrix in situ: the C-terminus is a principal determinant for nuclear trafficking.</a> J Cell Biochem. 68, 500-510 (1998).</li><li>Melan, M. A., Sluder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redistribution+and+differential+extraction+of+soluble+proteins+in+permeabilized+cultured+cells.+Implications+for+immunofluorescence+microscopy.">Redistribution and differential extraction of soluble proteins in permeabilized cultured cells. Implications for immunofluorescence microscopy.</a> J Cell Sci. 101, 731-743 (1992).</li><li>Zou, N., Lin, B. Y., Duan, F., Lee, K. Y., Jin, G., Guan, R., Yao, G., Lefkowitz, E. J., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hinge+of+the+human+papillomavirus+type+11+E2+protein+contains+major+determinants+for+nuclear+localization+and+nuclear+matrix+association.">The hinge of the human papillomavirus type 11 E2 protein contains major determinants for nuclear localization and nuclear matrix association.</a> J. Virol. 74, 3761-3770 (2000).</li></ol>

आम समस्याओं और सुझावों: सभी या कक्षों की सबसे धोने के दौरान खो रहे हैं. धोने चरणों के दौरान तरल पदार्थ 6 अच्छी तरह से थाली coverslip परहेज के पक्ष में धीरे जोडी चाहिए. इसी तरह तरल पदार्थ सावधानी झुकाव ?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BSA</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9647-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNase I</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>DN25-1G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>poly-L-Lysine</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-8920</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>Chemical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EGTA</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>E4378-25G </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fomaldehyde</td>
<td>Chemical</td>
<td>BDH</td>
<td>284216N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PIPES</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-6757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>Chemical</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>S/8600/53</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>T-6876</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mounting Medium with DAPI</td>
<td>Chemical</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fugene 6 Transfection Reagent</td>
<td>Chemical</td>
<td>Roche </td>
<td>11814443001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histone H1</td>
<td>Antibodies</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-8030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lamin A/C</td>
<td>Antibodies</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-20681</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubulin-&alpha;</td>
<td>Antibodies</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-32293</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in situ subcellular fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells

प्रोटीन समारोह परिचित प्रोटीन स्थानीयकरण के लिए युग्मित है. हालांकि कुछ प्रोटीन एक विशिष्ट स्थान या subcellular डिब्बे के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं, कई प्रोटीन एक उप जनसंख्या है कि कसकर एक विशेष subcellular डोमेन या संरचना के साथ जुड़ा हुआ है के साथ एक मुक्त विदेशी मुद्रा में स्वतंत्र रूप से diffusing जनसंख्या के रूप में मौजूद हैं. सीटू subcellular fractionation में के दृश्य की अनुमति देता है प्रोटीन compartmentalization और भी उप आबादी है कि विशिष्ट संरचनाओं के लिए स्थानीयकरण प्रोटीन प्रकट कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, घुलनशील cytoplasmic प्रोटीन और शिथिल आयोजित परमाणु प्रोटीन को हटाने chromatin के साथ कुछ प्रतिलेखन कारकों के स्थिर सहयोग प्रकट कर सकते हैं. डीएनए के बाद पाचन कुछ मामलों में प्रोटीन और RNAs कि सामूहिक रूप से परमाणु पाड़ या परमाणु मैट्रिक्स कहा जाता है के नेटवर्क के साथ सहयोग कर सकते हैं प्रकट. यहाँ हम खुर्दबीन coverslips पर पक्षपाती और गैर पक्षपाती स्तनधारी कोशिकाओं के स्वस्थानी fractionation के दौरान आवश्यक कदम का वर्णन करता है. प्रोटीन दृश्य विशिष्ट एंटीबॉडी या फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है है. एंटीबॉडी और / या फ्लोरोसेंट रंजक है कि विशिष्ट डिब्बों या संरचनाओं के लिए मार्कर के रूप में में कार्य प्रोटीन स्थानीयकरण विस्तार में मैप करने के लिए अनुमति देते हैं सीटू fractionation में भी पश्चिमी करने के लिए प्रत्येक अंश में मौजूद प्रोटीन की मात्रा की तुलना सोख्ता के साथ संयुक्त किया जा सकता है.. यह सरल जैव रासायनिक दृष्टिकोण संघों है कि अन्यथा नहीं चल पाता रहेगा प्रकट कर सकते हैं.

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In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

खुर्दबीन coverslips पर स्तनधारी कोशिकाओं की स्वस्थानी subcellular fractionation में प्रोटीन स्थानीयकरण के दृश्य की अनुमति देता है.

पक्षपाती और गैर पक्षपाती स्तनधारी कोशिकाओं की स्वस्थानी Subcellular Fractionation

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Research

JoVE Journal

Biology

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

Trypsinizing और स्तनधारी कोशिकाओं Subculturing

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

आरएनएआई स्क्रीनिंग के लिए स्तनधारी कोशिकाओं में मिशन esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Clonogenic परख: पक्षपाती कक्ष

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

सेल चक्र स्थिति के स्तनधारी कोशिकाओं में विश्लेषण

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

एक जीनोम व्यापक पैमाने पर Polysome Fractionation और स्तनधारी Translatomes का विश्लेषण

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में हीम संश्लेषण स्तर की माप

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

इमेजिंग स्थानीय सीए<sup&gt; 2 +</sup&gt; संवर्धित स्तनधारी कोशिकाओं में सिग्नल

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

डायनामिक सेलुलर प्रोट्र्रेशन में प्रोटीन एकाग्रता के सॉफ़्टवेयर-सहायता प्राप्त ट्रैकिंग के लिए एक ग्राफ़िकल यूजर इंटरफेस

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

मस्तिष्क स्टेम कोशिकाओं में स्वस्थता के सिटू इम्युनोफ्लोरोइसेंट स्टाइनिंग में

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में जमीन राज्य घट सुपर संकल्प इमेजिंग

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...