Name: in situ subcellular fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells
Uploaded: 2010-07-23T17:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells at JoVE.com

Anyaporn Sawasdichai ve Nazefah Abdülhamit&#39;in doktora sırasıyla Kraliyet Tayland Hükümeti ve Malezya Hükümeti minnettarız Burslar. Bu çalışma, Wellcome Trust PSJ ve KG için verilen bir proje hibe tarafından finanse edildi. Ayrıca, Bristol Wolfson bio Tesisi Üniversitesi minnettarız.

I. fraksiyonasyon için hazırlanması Bu bölümde, poli-L-Lizin kaplı mikroskop lamelleri ve fraksiyonasyon önce hücre eki hazırlama açıklamaktadır. Hücrelerin Gerekirse geçici eki önce veya sonra ya protein ekspresyon vektörleri ile transfekte olabilir. A. poli-L-Lizin kaplı lamelleri hazırlanması <ol><li> Distile su 1mg/ml poli-L-Lizin bir çözüm hazırlayın. </li><li> Sallanan bir platform üzerinde en az 1 saat için 22 çözüm onları kul...

<ol>
	<li>Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopBP1+regulates+human+papillomavirus+type+16+E2+interaction+with+chromatin.">TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin.</a> J Virol. 81, 4338-4342 (2007).</li><li>Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Groucho/TLE/R-esp+proteins+associate+with+the+nuclear+matrix+and+repress+RUNX+(CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha))+dependent+activation+of+tissue-specific+gene+transcription.">Groucho/TLE/R-esp proteins associate with the nuclear matrix and repress RUNX (CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha)) dependent activation of tissue-specific gene transcription.</a> J Cell Sci. 113, 2221-2231 (2000).</li><li>Kowalczyk, A. M., Roeder, G. E., Green, K., Stephens, D. J., Gaston, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+induction+or+inhibition+of+apoptosis+by+HPV+proteins.">Measuring the induction or inhibition of apoptosis by HPV proteins.</a> Methods Mol. Med. 119, 419-432 (2005).</li><li>McLarren, K. W., Theriault, F. M., Stifani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+with+the+nuclear+matrix+and+interaction+with+Groucho+and+RUNX+proteins+regulate+the+transcription+repression+activity+of+the+basic+helix+loop+helix+factor+Hes1.">Association with the nuclear matrix and interaction with Groucho and RUNX proteins regulate the transcription repression activity of the basic helix loop helix factor Hes1.</a> J Biol. Chem. 276, 1578-1584 (2001).</li><li>McNeil, S., Guo, B., Stein, J. L., Lian, J. B., Bushmeyer, S., Seto, E., Atchison, M. L., Penman, S., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+the+YY1+transcription+factor+to+the+nucleolus+and+the+nuclear+matrix+in+situ:+the+C-terminus+is+a+principal+determinant+for+nuclear+trafficking.">Targeting of the YY1 transcription factor to the nucleolus and the nuclear matrix in situ: the C-terminus is a principal determinant for nuclear trafficking.</a> J Cell Biochem. 68, 500-510 (1998).</li><li>Melan, M. A., Sluder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redistribution+and+differential+extraction+of+soluble+proteins+in+permeabilized+cultured+cells.+Implications+for+immunofluorescence+microscopy.">Redistribution and differential extraction of soluble proteins in permeabilized cultured cells. Implications for immunofluorescence microscopy.</a> J Cell Sci. 101, 731-743 (1992).</li><li>Zou, N., Lin, B. Y., Duan, F., Lee, K. Y., Jin, G., Guan, R., Yao, G., Lefkowitz, E. J., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hinge+of+the+human+papillomavirus+type+11+E2+protein+contains+major+determinants+for+nuclear+localization+and+nuclear+matrix+association.">The hinge of the human papillomavirus type 11 E2 protein contains major determinants for nuclear localization and nuclear matrix association.</a> J. Virol. 74, 3761-3770 (2000).</li></ol>

Yaygın sorunlar ve öneriler: Hücrelerin tamamı ya da bir çoğunu yıkama sırasında kaybolur. Yıkama adımları sırasında sıvı lamel kaçınarak 6 plaka yan yavaş yavaş ilave edilmelidir. Benzer şekilde, dikkatli bir şekilde devirme levha ile sıvı kaldırıldı olmalıdır ve aşırı sıvı yavaş yavaş pipetleme. Hücre adezyon poli-L-Lizin kaplı lamelleri kullanarak artırılabilir. Genomik DNA&#39;nın tamamen sindirilmiş değildir. Bazı hü...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BSA</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9647-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNase I</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>DN25-1G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>poly-L-Lysine</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-8920</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>Chemical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EGTA</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>E4378-25G </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fomaldehyde</td>
<td>Chemical</td>
<td>BDH</td>
<td>284216N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PIPES</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-6757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>Chemical</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>S/8600/53</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Chemical</td>
<td>Sigma</td>
<td>T-6876</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mounting Medium with DAPI</td>
<td>Chemical</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fugene 6 Transfection Reagent</td>
<td>Chemical</td>
<td>Roche </td>
<td>11814443001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histone H1</td>
<td>Antibodies</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-8030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lamin A/C</td>
<td>Antibodies</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-20681</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubulin-&alpha;</td>
<td>Antibodies</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-32293</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in situ subcellular fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells

Protein fonksiyonu yakından protein lokalizasyonuna birleştirilmiştir. Yerinde Subselüler fraksiyonasyon bazı proteinler belirli bir konuma veya hücre içi bölmesi ile sınırlı olmasına rağmen, birçok protein, belirli bir Subselüler etki alanı veya yapısı ile sıkı sıkıya ilişkili bir alt nüfusa sahip, serbest döviz serbestçe difüzyon nüfus olarak mevcuttur. görselleştirme sağlar protein bölümlendirme ve aynı zamanda protein belirli yapılara lokalize alt-topluluklarda ortaya çıkarabilir. Örneğin, çözünür sitoplazmik proteinleri ve gevşek tutulan nükleer proteinlerin çıkarılması kromatin ile bazı transkripsiyon faktörleri istikrarlı bir ilişki ortaya çıkarabilir. DNA sonraki sindirim topluca nükleer iskele veya nükleer matriks denir protein ve RNA ağı ile birlikte, bazı durumlarda ortaya çıkarabilir. Burada, yapışık ve yapışmaz memeli hücrelerinin mikroskop lamelleri yerinde fraksiyonasyon sırasında gerekli adımları açıklar . Protein görselleştirme spesifik antikorların ya da floresan füzyon proteinleri ve floresan mikroskopi kullanılarak elde edilebilir. Antikorlar ve / veya özel bölme ya da yapılar için belirteç olarak hareket floresan boyalar protein yerelleştirme ayrıntılı olarak eşlenen izin yerinde fraksiyonasyon da batı her fraksiyon protein miktarları karşılaştırmak için blot ile kombine edilebilir. Bu basit biyokimyasal yaklaşım, aksi tespit edilmemiş kalacaktı dernekler ortaya çıkarabilir.

Watch this Scientific Journal Video about In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells at JoVE.com

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

, Memeli hücrelerinin mikroskop lamelleri yerinde Subselüler fraksiyonasyon protein localisation görselleştirme sağlar .

Yapışkan ve Sigara yapışık Memeli Hücre yerinde Subselüler Fraksiyonu

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Research

JoVE Journal

Biology

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

Memeli Hücreleri Trypsinizing ve alt kültüre

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Clonogenic Testi: yapışkan Hücreler

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Bir genom Ölçeği Polizom Fraksiyonu ve Memeli Translatomes Analizi

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerde Heme Sentezi Düzeylerinin Ölçümü

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Otofajinin Kas Hücrelerinde Yerinde İmmunofloresan Boyanması

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Memeli hücrelerinde devlet tükenmesi süper kararlılık düşsel yer

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...