Name: derivation of mouse trophoblast stem cells from blastocysts
Uploaded: 2010-06-08T17:03:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts at JoVE.com

De auteurs danken Janet Rossant voor het oorspronkelijke protocol. Deze studie werd ondersteund door de National Institute of Health te verlenen CA106308 aan WH.

In dit protocol beschrijven we de voorbereiding van de muis blastocysten en de vestiging van TS cellijnen. Algemeen muis manipulaties voorafgaand aan het verzamelen van blastocysten, waaronder de instelling voor natuurlijke bevruchting en de inductie van de super ovulatie, in principe volgen de standaard protocol geïllustreerd door Nagy et al.. 2003 (pp146-150). Afleiding en het onderhoud van de TS-cellen <ol><li> Setup fokken kruising tussen muizen van belang. </li><li> Bereid j...

<ol>
	<li>Chiu, S. Y., Asai, N., Costantini, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Hsu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-specific+protease+2+is+essential+for+modulating+p53-Mdm2+in+development+of+trophoblast+stem+cell+niches+and+lineages.">SUMO-specific protease 2 is essential for modulating p53-Mdm2 in development of trophoblast stem cell niches and lineages.</a> PLoS Biol. 6, E310-E310 (2008).</li><li>Kunath, T., Arnaud, D., Uy, D. G., Okamoto, I., Chureau, C., Yamanaka, Y., Heard, E., Gardner, R. L., Avner, P., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinted+X-inactivation+in+extra-embryonic+endoderm+cell+lines+from+mouse+blastocysts.">Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts.</a> Development. 132, 1649-1661 (2005).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: The Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4.">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li></ol>

In deze video, tonen we het proces om E3.5 blastocysten van baarmoeders en experimentele procedures verzamelen om TS cellijnen vast te stellen. We beschrijven ook de voorwaarde om de stemness van TS cellen te handhaven en hun differentiatie te induceren in de gedifferentieerde cellen. Twee cruciale stappen om pure TS cellijnen te verkrijgen zijn de timing voor de uitgroei disaggregatie (stap 9) en de verwerking van de eerste passage (stap 11). Het is gemeld dat de primitieve endoderm-afgeleide cellen kunnen voordoen in ...

Reagentia TS medium: RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM natrium pyruvaat, 100 mM beta-mercapto-ethanol en 100 mg / ml penicilline-streptomycine. Mitomycine C: Los 2 mg mitomycine C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS en voeg deze 2 ml mengsel in 200 ml TS medium (10 ng / ml). Maak 20 aliquots (10 ml) en bewaar bij -20 ° C tot gebruik. Voeg een aliquot per 100 mm plaat. Muis embryonale fibroblast-conditie medium (MEF-CM): Plaat MEFs in 100 mm platen (1 x 10 6 / plaat). De volgende dag, voeg 10 ml TS medium per schotel en blijven tot cultuur voor 48 uur. Verzamel het kweekmedium, filteren (0,45 mm) en bewaar bij -20 ° C in 35 ml porties. Dooi elk aliquot wanneer dat nodig is, die kan worden opgeslagen bij 4 ° C. De MEF kan gebruikt worden om voor te bereiden op nog twee partijen CM voordat ze confluent. PBS / BSA: Los BSA, fractie V (Sigma A3311, 0,1% (w / v)) in PBS (10 ml), filter door middel van een 0,45 mm spuitfilter en maak 1 ml monsters in 1,5 ml buizen. Bewaren bij -70 ° C en dooi een tube als dat nodig is om FGF4 voor te bereiden. FGF4 (1000x): Resuspendeer gevriesdroogde FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) met 1 ml van het PBS / BSA-oplossing. Meng goed en 10 aliquots (100 ml) in 1,5 ml buizen en op te slaan maken bij -70 ° C. Dooi elke buis wanneer dat nodig is en bewaar de rest bij 4 ° C, niet opnieuw invriezen. Verdunnen 1000 keer in de TS middellange tot 1x FGF4 (25 ng / ml) te verkrijgen. Heparine (1000x): Resuspendeer heparine (Sigma H3149, 10.000 eenheden) in PBS tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg / ml (1000x). Maak 100 ml tot 1,5 ml buisjes en bewaar bij -70 ° C. Dooi aliquots wanneer dat nodig is en bewaar de rest bij 4 ° C, niet opnieuw invriezen. Verdunnen 1000 keer in TS middellange tot 1x heparine (1 ng / ml) te verkrijgen.

derivation of mouse trophoblast stem cells from blastocysts

Specificatie van de trophectoderm is een van de eerste differentiatie gebeurtenissen van zoogdieren ontwikkeling. De trofoblast lijn afkomstig van de trophectoderm bemiddelt implantatie en genereert de foetale deel van de placenta. Als gevolg hiervan, de ontwikkeling van deze lijn is van essentieel belang voor de overleving van embryo&#39;s. Afleiding van trofoblast stam (TS) cellen van muizen blastocysten werd voor het eerst beschreven door Tanaka<em&gt; Et al..</em&gt; 1998. Het vermogen van TS cellen aan de trofoblast specifieke eigenschap en hun expressie van het podium-en celtype-specifieke merkers te behouden na een goede stimulatie biedt een waardevol model systeem om trofoblast lineage ontwikkeling te onderzoeken, waarbij indient vroege placentatie evenementen. Verder trofoblast cellen zijn een van de weinige somatische celtypen ondergaat natuurlijke genoom versterking. Hoewel de moleculaire pathways onderliggende trofoblast polyploidization zijn begonnen te ontrafelen, de fysiologische rol en profiteer van trofoblast genoom versterking blijft grotendeels ongrijpbaar. De ontwikkeling van diploïde stamcellen in polyploïde trofoblast cellen in cultuur maakt dit<em&gt; Ex vivo</em&gt; Systeem een ​​uitstekend hulpmiddel voor het ophelderen van het reguleringsmechanisme van genoom replicatie en instabiliteit in gezondheid en ziekte. Hier beschrijven we een protocol op basis van eerdere rapporten met wijzigingen gepubliceerd in Chiu<em&gt; Et al..</em&gt; 2008.

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts at JoVE.com

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

In deze video, tonen we de isolatie van de muis blastocysten en de afleiding van trofoblast stamcellen uit blastocysten. We beschrijven ook de voorwaarden voor het onderhoud van de stamcel terrein en in de inductie van differentiatie in cultuur.

Afleiding van Mouse trofoblast stamcellen uit blastocysten

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Afleiding van hematopoietische stamcellen van muriene embryonale stamcellen

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Afleiding van menselijke embryonale stamcellen door Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolatie en Afleiding van muis embryonale cellen Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolatie van het netvlies stamcellen van de muis Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Isolatie van primaire Muis trofoblast cellen en Trofoblastinvasie Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generatie van Muizen Afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Seriële Verrijking van spermatogonia stam-en progenitorcellen (SSC&#39;s) in cultuur voor het afleiden van lange termijn Adult Mouse SSC Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Inductie en analyse van epitheliale naar mesenchymale transitie

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolatie en Cultuur van Dental epitheliale stamcellen van de volwassen muis Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...