Name: derivation of mouse trophoblast stem cells from blastocysts
Uploaded: 2010-06-08T17:03:00
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Les auteurs remercient Janet Rossant pour le protocole initial. Cette étude a été soutenue par l&#39;Institut national de la Santé accorde CA106308 à WH.

Dans ce protocole, nous décrivons la préparation de blastocystes de souris et de la création de lignées de cellules TS. Manipulations de souris générale préalable à la collecte de blastocystes, y compris la mise en place pour l&#39;accouplement naturel et l&#39;induction de l&#39;ovulation super, essentiellement suivi le protocole standard illustré par Nagy et al. 2003 (pp146-150). Dérivation et la maintenance des cellules TS <ol><li> Croisées entre les souris d&#39;él...

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	<li>Chiu, S. Y., Asai, N., Costantini, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Hsu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-specific+protease+2+is+essential+for+modulating+p53-Mdm2+in+development+of+trophoblast+stem+cell+niches+and+lineages.">SUMO-specific protease 2 is essential for modulating p53-Mdm2 in development of trophoblast stem cell niches and lineages.</a> PLoS Biol. 6, E310-E310 (2008).</li><li>Kunath, T., Arnaud, D., Uy, D. G., Okamoto, I., Chureau, C., Yamanaka, Y., Heard, E., Gardner, R. L., Avner, P., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinted+X-inactivation+in+extra-embryonic+endoderm+cell+lines+from+mouse+blastocysts.">Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts.</a> Development. 132, 1649-1661 (2005).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: The Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4.">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li></ol>

Dans cette vidéo, nous démontrons le processus de collecte E3.5 blastocystes à partir des procédures de l&#39;utérus et d&#39;expérimentation pour établir des lignées de cellules TS. Nous décrivons également la condition de maintenir le caractère souche de cellules TS et d&#39;induire leur différenciation en cellules différenciées. Deux étapes essentielles pures pour obtenir des lignées de cellules TS sont le moment de la désagrégation prolongement (étape 9) et le traitement du premier passage (étape...

Réactifs Milieu TS: RPMI-1640, 20% de FBS, 1 mM pyruvate de sodium, 100 mM de bêta-mercaptoéthanol et 100 mg / ml de pénicilline-streptomycine. Mitomycine C: Dissoudre 2 mg de mitomycine C (Sigma M-0503) dans 2 ml de PBS et ajouter ce mélange de 2 ml dans 200 ml TS moyenne (10 ng / ml). Faire 20 aliquotes (10 ml) et conserver à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. Ajouter une aliquote par 100 mm Plaque. Fibroblastes embryonnaires de souris-état moyen (MEF-CM): Plaque de MEFs plaques de 100 mm (1 x 10 6 / plaque). Le lendemain, ajoutez 10 ml TS moyenne par plat et continuer à la culture pendant 48 heures. Recueillir le milieu de culture, de les filtrer (0,45 mm) et conserver à -20 ° C dans 35 ml aliquotes. Dégel chaque aliquote lorsque cela est nécessaire, qui peut être conservé à 4 ° C. La FAE peut être utilisé pour préparer plus de deux lots de CM avant qu&#39;ils ne deviennent confluentes. PBS / BSA: Dissoudre BSA fraction, V (Sigma A3311, 0,1% (p / v)) dans du PBS (10 ml), filtrer à travers un filtre de 0,45 mm seringue et faire des aliquotes de 1 ml dans des tubes de 1,5 ml. Stocker à -70 ° C et le dégel d&#39;un tube en cas de besoin pour préparer FGF4. FGF4 (1000x): Resuspendre lyophilisé FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) avec 1 ml de la solution de PBS / BSA. Mélangez bien et faites des aliquots de 10 (100 ml) dans des tubes de 1,5 ml et conserver à -70 ° C. Dégel chaque tube en cas de besoin et de stocker le reste à 4 ° C, ne pas recongeler. Diluer 1000 fois dans du milieu TS pour obtenir 1x FGF4 (25 ng / ml). L&#39;héparine (1000x): Resuspendre héparine (Sigma H3149, 10.000 unités) dans du PBS à une concentration finale de 1 mg / ml (1000x). Faire des aliquots de 100 ml dans des tubes de 1,5 ml et conserver à -70 ° C. Aliquotes dégel si nécessaire et stocker le reste à 4 ° C, ne pas recongeler. Diluer 1000 fois dans le milieu de TS pour obtenir 1x héparine (1 ng / ml).

derivation of mouse trophoblast stem cells from blastocysts

Spécification du trophectoderme est l&#39;un des événements les plus anciens de différenciation du développement des mammifères. La lignée dérivée de trophoblaste trophectoderme médie l&#39;implantation et génère la partie foetale du placenta. En conséquence, le développement de cette lignée est essentielle pour la survie des embryons. Dérivation de la tige du trophoblaste (TS), les cellules à partir de blastocystes de souris a été décrite par Tanaka<em&gt; Et al.</em&gt; 1998. La capacité des cellules TS afin de préserver la propriété trophoblaste spécifiques et leur expression de la scène et du type de cellules de marqueurs spécifiques après stimulation adéquate fournit un système modèle intéressant d&#39;étudier le développement lignée trophoblaste lequel récapitulant les événements placentation tôt. Par ailleurs, les cellules trophoblastiques sont l&#39;un des rares types de cellules somatiques en cours d&#39;amplification du génome naturel. Bien que les voies moléculaires qui sous-tendent polyploïdisation du trophoblaste ont commencé à se dénouer, le rôle physiologique et l&#39;avantage de l&#39;amplification du génome du trophoblaste reste largement insaisissable. Le développement des cellules souches diploïdes dans les cellules trophoblastiques polyploïdes dans la culture fait de ce<em&gt; Ex vivo</emSystème&gt; un excellent outil pour élucider le mécanisme de régulation de la réplication du génome et de l&#39;instabilité dans la santé et la maladie. Nous décrivons ici un protocole basé sur les rapports antérieurs à la modification publiée dans Chiu<em&gt; Et al.</em&gt; 2008.

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Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Dans cette vidéo, nous démontrons l&#39;isolement des blastocystes de souris et de la dérivation de cellules souches trophoblastiques à partir de blastocystes. Nous décrivons également les conditions d&#39;entretien de la propriété de cellules souches ainsi que l&#39;induction de la différenciation en culture.

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