Name: derivation of mouse trophoblast stem cells from blastocysts
Uploaded: 2010-06-08T17:03:00
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Die Autoren danken Janet Rossant für das ursprüngliche Protokoll. Diese Studie wurde vom National Institute of Health gewähren CA106308 zu WH unterstützt.

In diesem Protokoll, beschreiben wir die Herstellung von Maus-Blastozysten und die Einrichtung von TS-Zelllinien. Allgemeine Maus Manipulationen vor der Sammlung von Blastozysten, einschließlich der Einrichtung für die natürliche Paarung und die Induktion von Super Eisprung folgen grundsätzlich dem Standard-Protokoll von Nagy et al dargestellt. 2003 (pp146-150). Ableitung und Wartung von TS-Zellen <ol><li> Setup-Zucht Kreuzung zwischen Mäusen von Interesse. </li><li> Bereiten...

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	<li>Chiu, S. Y., Asai, N., Costantini, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Hsu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-specific+protease+2+is+essential+for+modulating+p53-Mdm2+in+development+of+trophoblast+stem+cell+niches+and+lineages.">SUMO-specific protease 2 is essential for modulating p53-Mdm2 in development of trophoblast stem cell niches and lineages.</a> PLoS Biol. 6, E310-E310 (2008).</li><li>Kunath, T., Arnaud, D., Uy, D. G., Okamoto, I., Chureau, C., Yamanaka, Y., Heard, E., Gardner, R. L., Avner, P., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinted+X-inactivation+in+extra-embryonic+endoderm+cell+lines+from+mouse+blastocysts.">Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts.</a> Development. 132, 1649-1661 (2005).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: The Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4.">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li></ol>

In diesem Video zeigen wir, den Prozess zu E3.5 Blastozysten aus uteri und experimentellen Verfahren zu sammeln, um TS-Zelllinien zu etablieren. Wir beschreiben auch die Voraussetzung für die Stammzell-Seins der TS-Zellen zu erhalten und deren Differenzierung in differenzierten Zellen zu induzieren. Zwei entscheidende Schritte zur reinen TS-Zelllinien zu erhalten sind das Timing für Auswuchs Disaggregation (Schritt 9) und die Verarbeitung der ersten Passage (Schritt 11). Es wurde berichtet, dass primitive Endoderm-abg...

Reagenzien TS-Medium: RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM Natriumpyruvat, 100 mM beta-Mercaptoethanol und 100 mg / ml Penicillin-Streptomycin. Mitomycin C: Lösen Sie 2 mg Mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS und stell &#39;das 2 ml Mischung in 200 ml TS-Medium (10 ng / ml). Machen Sie 20 Portionen (10 ml) und bei -20 ° C bis zur Verwendung. Fügen Sie ein Aliquot pro 100 mm-Platte. Maus embryonale Fibroblasten-Zustand Medium (MEF-CM): Platte MEFs in 100 mm-Platten (1 x 10 6 / Platte). Am nächsten Tag, 10 ml TS Medium pro Schale und weiterhin Kultur für 48 Stunden. Sammeln Sie das Kulturmedium, filtern (0,45 mm) und bei -20 ° C in 35 ml Aliquots. Thaw jedes Aliquot, wenn nötig, die bei 4 gespeichert werden können ° C. Die MEFs kann für zwei weitere Chargen von CM vorbereiten, bevor sie konfluent geworden sein. PBS / BSA: Lösen BSA, Fraktion V (Sigma A3311, 0,1% (w / v)) in PBS (10 ml), filtriert durch ein 0,45 mm Spritzenfilter und machen 1 ml Aliquots in 1,5 ml Röhrchen. Lagerung bei -70 ° C und Auftauen einer Röhre, wenn benötigt, um FGF4 vorzubereiten. FGF4 (1000x): Resuspendieren lyophilisiert FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) mit 1 ml der PBS / BSA-Lösung. Gut mischen und machen 10 Aliquots (100 ml) in 1,5 ml Röhrchen und lagern bei -70 ° C. Thaw jedes Röhrchen bei Bedarf und speichern Sie die restlichen bei 4 ° C, nicht wieder einfrieren. Verdünnen 1000 mal in TS-Medium auf 1x FGF4 (25 ng / ml) zu erhalten. Heparin (1000x): Resuspendieren Heparin (Sigma H3149, 10.000 Einheiten) in PBS bis zu einer Endkonzentration von 1 mg / ml (1000x). Machen Sie 100 ml Aliquots in 1,5 ml Röhrchen und lagern bei -70 ° C. Thaw Aliquots bei Bedarf und speichern Sie die restlichen bei 4 ° C, nicht wieder einfrieren. Verdünnen 1000 mal in TS-Medium auf 1x Heparin (1 ng / ml) zu erhalten.

derivation of mouse trophoblast stem cells from blastocysts

Spezifikation der Trophektoderm ist eine der frühesten Differenzierung Veranstaltungen von Säugetier-Entwicklung. Der Trophoblast Linie aus dem Trophektoderm vermittelt Implantation abgeleitet und generiert die fetalen Teil der Plazenta. Als Ergebnis ist die Entwicklung dieser Linie wichtig für den Embryo Überleben. Herleitung der Trophoblasten Stammzellen (TS)-Zellen von Maus Blastozysten wurde zuerst von Tanaka beschrieben<em&gt; Et al.</em&gt; 1998. Die Fähigkeit der TS-Zellen, die Trophoblasten spezifische Eigenschaft und ihre Expression von Bühnen-und Zelltyp-spezifische Marker nach entsprechender Stimulation erhalten eine wertvolle Modellsystem, um die Trophoblasten Abstammung Entwicklung zu untersuchen, wobei Rekapitulation frühen Plazentation Veranstaltungen. Darüber hinaus sind Trophoblastzellen einer der wenigen somatische Zelltypen unterziehen natürliche Genome Amplification. Obwohl die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen Trophoblasten Polyploidisierung begonnen haben, zu entwirren, bleibt die physiologische Rolle und der Vorteil der Trophoblast Genomamplifikationstechnik weitgehend ungeklärt. Die Entwicklung der diploiden Stammzellen in polyploiden Trophoblast-Zellen in Kultur macht diese<em&gt; Ex vivo</em&gt; System das perfekte Werkzeug für die Aufklärung der regulatorischen Mechanismus der Genom-Replikation und Instabilität in Gesundheit und Krankheit. Hier beschreiben wir ein Protokoll über die früheren Berichte mit Modifikationen in Chiu veröffentlichten<em&gt; Et al.</em&gt; 2008.

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Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

In diesem Video zeigen wir die Isolierung der Maus Blastozysten und die Ableitung der Trophoblast-Stammzellen aus Blastozysten. Wir beschreiben auch Bedingungen für die Wartung der Stammzell-Eigenschaft sowie die Induktion der Differenzierung in Kultur.

Ableitung der Maus Trophoblast Stammzellen aus Blastozysten

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Forschung

Biologie

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolierung von Retinal Stammzellen aus der Maus Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Isolation of Primary Maus Trophoblastzellen und Trophoblastinvasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Serielle Anreicherung von Spermatogonien Stamm-und Progenitorzellen (SSC) in der Kultur für die Ableitung des langfristigen adulten Maus SSC Linien

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolation und Kultur der Dental epithelialen Stammzellen aus dem erwachsenen Maus Schneidezahn

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...