Name: derivation of mouse trophoblast stem cells from blastocysts
Uploaded: 2010-06-08T17:03:00
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Os autores agradecem Janet Rossant para o protocolo original. Este estudo foi financiado pelo Instituto Nacional de Saúde para conceder CA106308 WH.

Neste protocolo, descrevemos a preparação de blastocistos do mouse e do estabelecimento de linhas de células TS. Manipulações do mouse geral antes da coleta de blastocistos, incluindo a criação de acasalamento natural e na indução da ovulação super, basicamente, seguir o protocolo padrão ilustrado por Nagy et al. 2003 (pp146-150). Derivação e manutenção das células TS <ol><li> Cruz configuração cruzamento entre ratos de interesse. </li><li> Prepare fibroblastos ...

<ol>
	<li>Chiu, S. Y., Asai, N., Costantini, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Hsu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-specific+protease+2+is+essential+for+modulating+p53-Mdm2+in+development+of+trophoblast+stem+cell+niches+and+lineages.">SUMO-specific protease 2 is essential for modulating p53-Mdm2 in development of trophoblast stem cell niches and lineages.</a> PLoS Biol. 6, E310-E310 (2008).</li><li>Kunath, T., Arnaud, D., Uy, D. G., Okamoto, I., Chureau, C., Yamanaka, Y., Heard, E., Gardner, R. L., Avner, P., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinted+X-inactivation+in+extra-embryonic+endoderm+cell+lines+from+mouse+blastocysts.">Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts.</a> Development. 132, 1649-1661 (2005).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: The Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4.">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li></ol>

Neste vídeo, demonstramos o processo de coletar E3.5 blastocistos de procedimentos uterino e experimental para estabelecer linhagens de células TS. Descrevemos também a condição para manter a stemness de células TS e induzir sua diferenciação em células diferenciadas. Dois passos fundamentais para obter linhagens de células pura TS são o tempo para desagregação conseqüência (passo 9) e processamento de primeira passagem (passo 11). Tem sido relatado que a primitiva endoderme células derivadas podem surgi...

Reagentes Médio TS: RPMI-1640, 20% FBS, piruvato de sódio 1 mM, 100 mM beta-mercaptoetanol e 100 mg / ml de penicilina-estreptomicina. Mitomicina C: Dissolver 2 mg mitomicina C (Sigma M-0503) em 2 ml de PBS e adicione essa mistura de 2 ml em 200 ml de médio TS (10 ng / ml). Fazer 20 alíquotas (10 ml) e armazenar a -20 ° C até o uso. Adicionar uma alíquota por 100 placa mm. Embrionárias de camundongos médio de fibroblastos-condição (MEF-CM): Placa MEFs em 100 placas mm (1 x 10 6 / placa). No dia seguinte, adicione 10 ml de meio de TS por prato e continuar a cultura por 48 horas. Recolher o meio de cultura, filtrá-los (0,45 mm) e armazenar a -20 ° C em 35 alíquotas ml. Descongelar cada alíquota, quando necessário, que pode ser armazenado a 4 ° C. O MEFs pode ser usado para se preparar para mais dois lotes da CM antes que eles se tornam confluentes. PBS / BSA: Dissolver BSA, fração V (Sigma A3311, de 0,1% (w / v)) em PBS (10 ml), através de um filtro de seringa de 0,45 milímetros de filtro e fazer um alíquotas ml em tubos de 1,5 ml. Armazenar a -70 ° C e descongelar um tubo quando necessário para preparar FGF4. FGF4 (1000x): Ressuspender liofilizado FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) com 1 ml da solução de PBS / BSA. Misture bem e fazer 10 alíquotas (100 ml) em tubos de 1,5 ml e armazenar a -70 ° C. Descongelar cada tubo quando necessário e guardar o restante a 4 ° C, não re-congelar. Diluída 1000 vezes em meio TS para obter 1x FGF4 (25 ng / ml). Heparina (1000x): Ressuspender heparina (Sigma H3149, 10.000 unidades) em PBS para uma concentração final de 1 mg / ml (1000x). Fazer 100 ml alíquotas em tubos de 1,5 ml e armazenar a -70 ° C. Alíquotas descongelar quando necessário e guardar o restante a 4 ° C, não voltar a congelar. Diluir 1000 tempo em meio TS para obter 1x heparina (1 ng / ml).

derivation of mouse trophoblast stem cells from blastocysts

Especificação do trofectoderma é um dos eventos mais antigos diferenciação de desenvolvimento dos mamíferos. A linhagem trofoblasto derivados a partir da implantação medeia trofectoderma e gera a parte fetal da placenta. Como resultado, o desenvolvimento desta linhagem é essencial para a sobrevivência do embrião. Derivação de trofoblasto haste (TS) células de blastocistos mouse foi primeiramente descrita por Tanaka<em&gt; Et al.</em&gt; 1998. A capacidade das células TS para preservar a propriedade trofoblasto específicos e sua expressão de palco e de células de tipo específico marcadores após a estimulação adequada fornece um sistema modelo valioso para investigar o desenvolvimento da linhagem trofoblasto qual recapitulando eventos placentação cedo. Além disso, as células do trofoblasto são um dos poucos tipos de células somáticas submetidos a amplificação do genoma natural. Ainda que os percursos moleculares subjacentes poliploidização trofoblasto começaram a desvendar, o papel fisiológico e vantagem de amplificação do genoma do trofoblasto permanece em grande parte ilusória. O desenvolvimento de células-tronco em células diplóides trofoblasto poliplóide na cultura torna este<em&gt; Ex vivo</emSistema de&gt; uma excelente ferramenta para elucidar o mecanismo de regulação da replicação do genoma e da instabilidade na saúde e na doença. Aqui nós descrevemos um protocolo com base em relatórios anteriores com modificação publicado em Chiu<em&gt; Et al.</em&gt; 2008.

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Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de blastocistos mouse ea derivação de células-tronco de blastocistos trofoblasto. Descrevemos também condições para a manutenção da propriedade de célula-tronco, bem como a indução de diferenciação em cultura.

Derivação de células-tronco do rato trofoblasto de blastocistos

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Biologia

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Derivação de células estaminais embrionárias humanas por Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolamento e derivação de células embrionárias de rato Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolamento de Células-Tronco da retina do olho do rato

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Isolamento de células primário do mouse trofoblasto e Ensaio invasão do trofoblasto

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Thus, defects ...

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Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Enriquecimento de série-tronco de esperma e células progenitoras (SSC) em Cultura para Derivação de longo prazo Adultos Linhas rato SSC

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...