Name: derivation of mouse trophoblast stem cells from blastocysts
Uploaded: 2010-06-08T17:03:00
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Los autores agradecen a Janet Rossant para el protocolo original. Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud de subvención CA106308 de WH.

En este protocolo, se describe la preparación de los blastocistos de ratón y el establecimiento de líneas de células TS. Manipulaciones generales del ratón antes de la recolección de los blastocistos, incluyendo la puesta a punto para el apareamiento natural y la inducción de la superovulación, básicamente, seguir el protocolo estándar ilustrado por Nagy et al. 2003 (pp146-150). Derivación y el mantenimiento de las células TS <ol><li> Configuración de cruzamiento entr...

<ol>
	<li>Chiu, S. Y., Asai, N., Costantini, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Hsu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-specific+protease+2+is+essential+for+modulating+p53-Mdm2+in+development+of+trophoblast+stem+cell+niches+and+lineages.">SUMO-specific protease 2 is essential for modulating p53-Mdm2 in development of trophoblast stem cell niches and lineages.</a> PLoS Biol. 6, E310-E310 (2008).</li><li>Kunath, T., Arnaud, D., Uy, D. G., Okamoto, I., Chureau, C., Yamanaka, Y., Heard, E., Gardner, R. L., Avner, P., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinted+X-inactivation+in+extra-embryonic+endoderm+cell+lines+from+mouse+blastocysts.">Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts.</a> Development. 132, 1649-1661 (2005).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: The Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4.">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li></ol>

En este vídeo, que muestran el proceso para recoger E3.5 blastocistos de los procedimientos de útero y experimentales para establecer las líneas de células TS. También describe la condición de mantener la troncalidad de las células TS y para inducir su diferenciación en células diferenciadas. Dos pasos críticos para obtener líneas puras de células TS son el momento para la desagregación consecuencia (paso 9) y el procesamiento del primer paso (paso 11). Se ha informado de que la primitiva endodermo derivado...

Reactivos TS medio: RPMI-1640, 20% de SFB, 1 mM piruvato de sodio, 100 mM ß-mercaptoetanol y 100 mg / ml de penicilina-estreptomicina. Mitomicina C: Disolver 2 mg de mitomicina C (Sigma M-0503) en 2 ml de PBS y añadir esta mezcla de 2 ml a 200 ml de medio TS (10 ng / ml). Hacer 20 alícuotas (10 ml) y se almacena a -20 ° C hasta su uso. Añadir una alícuota por placa de 100 mm. Fibroblastos de embriones de ratón condición media (MEF-CM): Placa MEFs en placas de 100 mm (1 x 10 6 / placa). Al día siguiente, agregar 10 ml de medio de TS por plato y continuar a la cultura durante 48 horas. Recoger el medio de cultivo, filtrarlos (0,45 mm) y se almacena a -20 ° C en alícuotas de 35 ml. Descongele cada alícuota cuando sea necesario, que se pueden almacenar a 4 ° C. El MEFs se puede utilizar para preparar dos lotes más de CM antes de confluir. PBS / BSA: Disolver BSA, fracción V (Sigma A3311, un 0,1% (w / v)) en PBS (10 ml), a través de un filtro de jeringa de filtro de 0,45 mm y hacer alícuotas de 1 ml en tubos de 1,5 ml. Guardar a -70 ° C y descongelar un tubo cuando sea necesario para preparar FGF4. FGF4 (1000x): Resuspender liofilizado FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) con 1 ml de la solución de PBS / BSA. Mezclar bien y hacer alícuotas de 10 (100 ml) en tubos de 1,5 ml y almacenar a -70 ° C. Descongele cada tubo cuando sea necesario y guarde el resto a 4 ° C, no volver a congelar. Diluir 1000 veces en el medio de TS para obtener 1x FGF4 (25 ng / ml). Heparina (1000x): Volver a suspender la heparina (Sigma H3149, 10.000 unidades) en PBS a una concentración final de 1 mg / ml (1000x). Hacer alícuotas de 100 ml en tubos de 1,5 ml y almacenar a -70 ° C. Alícuotas de deshielo cuando sea necesario y guarde el resto en 4 ° C, no volver a congelar. Diluir 1000 tiempo en el medio de TS para obtener 1x heparina (1 ng / ml).

derivation of mouse trophoblast stem cells from blastocysts

Especificación de la trophectoderm es uno de los eventos tempranos de diferenciación de desarrollo de los mamíferos. El linaje trofoblasto derivado de la implantación trophectoderm media y genera la parte fetal de la placenta. Como resultado, el desarrollo de este linaje es esencial para la supervivencia de los embriones. Derivación de trofoblasto del tallo (TS) las células de los blastocistos de ratón fue descrito por primera vez por Tanaka<em&gt; Et al.</em&gt; 1998. La capacidad de las células TS para preservar la propiedad del trofoblasto específicas y su expresión de tipos específicos de etapa y marcadores de células después de la estimulación adecuada proporciona un sistema modelo valioso para investigar el desarrollo del trofoblasto linaje por el que recapitula los primeros eventos placentación. Además, las células del trofoblasto son uno de los pocos tipos de células somáticas sometidos a la amplificación del genoma natural. A pesar de las vías moleculares que subyacen a poliploidización trofoblasto han empezado a desentrañar el papel fisiológico y las ventajas de la amplificación del genoma trofoblasto permanece en gran parte difícil de alcanzar. El desarrollo de las células madre en células diploides trofoblasto poliploides en la cultura hace que este<em&gt; Ex vivo</em&gt; El sistema una excelente herramienta para dilucidar el mecanismo de regulación de la replicación del genoma y la inestabilidad en la salud y la enfermedad. A continuación se describe un protocolo basado en informes anteriores, con la modificación publicada en Chiu<em&gt; Et al.</em&gt; 2008.

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Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

En este vídeo, se demuestra el aislamiento de los blastocistos de ratón y la derivación de células madre del trofoblasto de los blastocistos. También describe las condiciones para el mantenimiento de la propiedad de células madre, así como la inducción de diferenciación en la cultura.

Derivación de células madre de ratón a partir de blastocistos Trofoblasto

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Investigación

Biología

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Derivación de células estaminales embrionarias humanas por Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

El aislamiento y la derivación de células embrionarias de ratón Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Aislamiento de células madre de la retina del ojo del ratón

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

El aislamiento de células primarias de ratón trofoblasto y ensayo de invasión trofoblasto

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivación eficiente de los Derechos Humanos precursores cardiacos y cardiomiocitos de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

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Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Enriquecimiento de serie de la madre de espermatogonias y células progenitoras (SSC) en Cultura para la derivación de largo plazo de ratones adultos Líneas SSC

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

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Aislamiento y cultivo de células madre epiteliales dental del adulto Ratón Incisivo

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