Name: derivation of mouse trophoblast stem cells from blastocysts
Uploaded: 2010-06-08T17:03:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts at JoVE.com

Författarna tackar Janet Rossant för den ursprungliga protokollet. Denna studie stöddes av National Institute of Health bidrag CA106308 till WH.

I detta protokoll beskriver vi beredning av musen blastocyster och upprättandet av TS cellinjer. Allmänna mus manipulationer före samlingen av blastocyster, inklusive de som inrättats för naturlig parning och framkallande av super ägglossning, följer i huvudsak standardprotokollet illustreras av Nagy et al. 2003 (pp146-150). Härledning och underhåll av TS celler <ol><li> Setup avel korsning mellan möss av intresse. </li><li> Förbered mus embryonala fibroblaster (MEFs) s...

<ol>
	<li>Chiu, S. Y., Asai, N., Costantini, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Hsu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-specific+protease+2+is+essential+for+modulating+p53-Mdm2+in+development+of+trophoblast+stem+cell+niches+and+lineages.">SUMO-specific protease 2 is essential for modulating p53-Mdm2 in development of trophoblast stem cell niches and lineages.</a> PLoS Biol. 6, E310-E310 (2008).</li><li>Kunath, T., Arnaud, D., Uy, D. G., Okamoto, I., Chureau, C., Yamanaka, Y., Heard, E., Gardner, R. L., Avner, P., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinted+X-inactivation+in+extra-embryonic+endoderm+cell+lines+from+mouse+blastocysts.">Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts.</a> Development. 132, 1649-1661 (2005).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: The Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4.">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li></ol>

I denna video visar vi processen att samla E3.5 blastocyster från livmoder och experimentella förfaranden för att fastställa TS cellinjer. Vi beskriver också tillståndet att upprätthålla stemness av TS celler och att få deras differentiering till differentierade celler. Två viktiga steg för att få rena linjer TS cell är tidpunkten för utväxt uppdelning (steg 9) och bearbetning första passagen (steg 11). Det har rapporterats att primitiva endoderm-härledda celler kan uppstå i kulturen efter omfattande b...

Reagenser TS medium: RPMI-1640, 20% FBS, 1 mm natrium pyruvat, 100 mm beta-merkaptoetanol och 100 mg / ml penicillin-streptomycin. Mitomycin C: Lös upp 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) i 2 ml PBS och lägga till denna 2 ml blandningen i 200 ml TS medelstora (10 ng / ml). Gör 20 portioner (10 ml) och förvara vid -20 ° C fram till användning. Lägg till en alikvot per 100 mm platta. Mus embryonala fibroblastliknande tillstånd medium (MEF-CM): Plate MEFs i 100 mm plattor (1 x 10 6 / platta). Nästa dag, tillsätt 10 ml TS medelstora per fat och fortsätter till kultur i 48 timmar. Samla odlingsmedium, filtrera dem (0,45 mm) och förvara vid -20 ° C i 35 ml alikvoter. Tina varje alikvot när det behövs som kan lagras vid 4 ° C. Den MEFs kan användas för att förbereda ytterligare två partier av CM innan de blir sammanhängande. PBS / BSA: Lös BSA, fraktion V (Sigma A3311, 0,1% (w / v)) i PBS (10 ml), filtrera genom ett 0,45 mm sprutfilter och gör 1 ml alikvoter i 1,5 ml rör. Förvaras vid -70 ° C och tina ett rör när det behövs för att förbereda FGF4. FGF4 (1000x): Resuspendera frystorkat FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) med 1 ml PBS / BSA-lösning. Blanda väl och gör 10 alikvoter (100 ml) i 1,5 ml rör och förvaras vid -70 ° C. Tina varje rör när det behövs och lagra de resterande vid 4 ° C, inte frysas. Späd 1000 gånger i TS medel för att få 1x FGF4 (25 ng / ml). Heparin (1000x): Resuspendera heparin (Sigma H3149, 10.000 enheter) i PBS för att en slutlig koncentration av 1 mg / ml (1000x). Gör 100 ml-portioner i 1,5 ml rör och förvaras vid -70 ° C. Tina portioner när det behövs och lagra de resterande vid 4 ° C, inte frysas. Späd 1000 tid i TS medel för att få 1x heparin (1 ng / ml).

derivation of mouse trophoblast stem cells from blastocysts

Specifikation av trophectoderm är en av de tidigaste differentiering händelserna i däggdjurens utveckling. Den trofoblasten härstamning kommer från trophectoderm förmedlar implantation och genererar fostrets del av moderkakan. Som ett resultat är utvecklingen av denna släkt viktigt för embryots överlevnad. Härledning av trofoblasten stamceller (TS) celler från mus blastocyster beskrevs först av Tanaka<em&gt; Et al.</em&gt; 1998. Förmåga TS cellerna att bevara trofoblaster specifika egendom och deras uttryck av steg-och celltyp-specifika markörer efter ordentlig stimulering ger en värdefull modell för att undersöka utvecklingen trofoblasten härstamning där rekapitulera tidigt placentation händelser. Dessutom trofoblasten celler är en av de få somatiska celltyper som genomgår naturlig arvsmassa förstärkning. Även om de molekylära vägar underliggande trofoblasten polyploidization har börjat riva upp, är de fysiologiska roll och nytta av trofoblasten genomet förstärkning i stort sett svårfångade. Utvecklingen av celler diploida stamceller i polyploida trofoblasten celler i kulturen gör detta<em&gt; Ex vivo</em&gt; Systemet ett utmärkt verktyg för att belysa den rättsliga mekanism genomet replikering och instabilitet i hälsa och sjukdom. Här beskriver vi ett protokoll baserat på tidigare rapporter med modifikation publiceras i Chiu<em&gt; Et al.</em&gt; 2008.

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts at JoVE.com

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

I denna video visar vi isolering av musen blastocyster och härledning av celler trofoblasten härrör från blastocyster. Vi beskriver också förutsättningarna för underhåll av stamceller egendom samt framkallande av differentiering i kultur.

Härledning av Stem Mus trofoblasten Celler från Blastocyster

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Härledning av hematopoetiska stamceller från Murine embryonala stamceller

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Derivering av mänskliga embryonala stamceller genom Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolering och Härledning av Mouse Embryonala Germinal celler

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolering av näthinnan stamceller från mus Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Isolering av primära celler Mus trofoblaster och trofoblaster Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Derivering av mänskliga Hjärtat prekursorer och Cardiomyocytes från Pluripotenta mänskliga embryonala stamcellslinjer med liten molekyl Induktion

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av möss härledda från inducerade pluripotenta stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Seriell Anrikning av spermatogoniala stam-och stamfaderceller (SSC) i Kultur för Härledning av långfristiga SSC vuxen mus Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion och Analys av Epithelial till mesenkymala övergång

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolering och kultur av Dental epitelceller stamceller från vuxen mus Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...