Name: in-vivo detection of protein-protein interactions on micro-patterned surfaces
Uploaded: 2010-03-19T17:30:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces at JoVE.com

ברצוננו להודות Quentina ביטי, אוניברסיטת לינץ, אוסטריה, על עזרתה האדיבה, קתרינה Strub, אוניברסיטת ג&#39;נבה, שוויץ, עבור הקמת hCD71-GFP, ודניאל Legler, אוניברסיטת קונסטנץ, שוויץ, עבור ה-GPI-GFP DAF-לבנות. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע האוסטרי (FWF; פרויקט Y250-B03) ואת פרויקט GEN-AU משרד האוסטרי למדע ומחקר.

Microcontact הדפסה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור שדה micropattern של הבול PDMS באמצעות אזמל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השדה המכיל את micropattern על ידי שטיפה זה עם אתנול (100%) ומים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש חותמת PDMS עם חנקן או גז ארגון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 50 μl-BSA Cy5 פתרון עבודה (0.67 מ&quot;ג / מ&quot;ל) על הבול PDMS כך שהשדה כולו micropattern מכוסה פתרון. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השדה micropattern על ידי שטיפה עם בופר פוספט (PBS) ומים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש PDMS עם חנקן או גז ארגון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החותמת PDMS תחת כובד משקלו על גבי באמצע coverslip אפוקסי מצופה אחד דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל את המיקום של החותמת PDMS על הישבן של coverslip לבין הרצועה החותמת משקופית עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Stick Secure חותם הכלאה קאמרית מעל שדה microcontact מודפס על coverslip. התווית עוזר למקם את מרכז השדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 60 streptavidin μl עבודה פתרון (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לתוך תא התגובה דגירה המדגם עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם עם 1 מ&quot;ל PBS על ידי הוספת מאגר ליציאת אחד של החדר ואת הסרתו בו זמנית בנמל השני עם משאבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 60 עובדים μl biotinylated פתרון נוגדן (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​PBS בתוספת 0.1% Tween 20: &quot;PBST&quot;) לתוך תא התגובה דגירה של 60 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם עם 1 מ&quot;ל PBST ולאחר מכן 1 מ&quot;ל PBS על ידי הוספת מאגר ליציאת אחד של החדר והסרת אותו שוב בנמל השני עם משאבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות משטחי micropatterned ב PBS בחושך בטמפרטורת החדר עד תאים מוכנים זריעה. </li></ol> דגירה של תאים על פני השטח micropatterned: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים חסיד אל מפגש 50% צלחת 3 רקמות ס&quot;מ תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק התאים לבטא הפיתיון טרף חלבונים עניין עם פתרון Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) חומצה צנטריפוגות 5 דקות ב 1000 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו לפזר את התא גלולה במדיום הגידול פי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו לפזר את התא גלולה במדיום הגידול המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבורסה PBS מהאולם תגובה על ידי coverslip micropatterned μl 60 השעיה של התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת תא humidified על ידי השריית משטח סטרילי במים מזוקקים ומכניסים אותו לתוך צלחת פטרי כדי למנוע מדגם ריצה יבשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים על פני הלילה בשעה 37 ° C באווירה 5% CO 2 על משטחים micropatterned. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ניתוח תאים במיקרוסקופ, חילופי בינוני שנאגרו על ידי פתרון של האנק מלח כולל Ca 2 + ו - Mg 2 +. </li></ol> מיקרוסקופית: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslip ממוקם על הר מתאימים את המורפולוגיה התא נבדק תחת אור לבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האיכות של ה-BSA Cy5 דפוסי נבדק על ידי עירור ב 647 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropatterns של חלבון פלואורסצנטי טרף (GFP או YFP) נרשמות 488 או 514 ננומטר תחת סך עירור פנימית השתקפות (TIR). </li></ol> נציג התוצאות: אם יש אינטראקציה בין חלבונים בתאים היעד גדל על משטח micropatterned, הטרף יעברו חלוקה מחדש הפיתיון. Micropattern וכתוצאה מכך ניתן דמיינו לפי תווית של חלבון פלואורסצנטי את הטרף. חשוב לציין את הניגוד המתקבל מספק מדידה ישירה של כוח האינטראקציה (ראה איור 1). לכן הערכה פשוטה של ​​אינטראקציה של שני חלבונים הופך אפשרי - ללא צורך להמשיך ולעבד את הנתונים העיקריים שנמדדו. <img src="/files/ftp_upload/1969/1969fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. סידור מחדש של הפיתיון בתוך קרום התא פלזמה לחיות בעוצמות אינטראקציה שונה. תמונות TIR של תאים T24 transfected עם (א) CD71-GFP על נוגדן CD71, (ב) ו - CD4 YFP cytosolic על נוגדנים CD4 ו - (ג) GPI-GFP-DAF-CD59 על נוגדן microbiochips מוצגים. נתונים אופייניים עבור חזקה (א), לא (ב) או אינטראקציה חלשה (ג). (א) מובא מן (Weghuber et al., In press), (ב) מ - (Schwarzenbacher et al. 2008).

<ol>
	<li>Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reply+to+"Uncoupling+diffusion+and+binding+in+FRAP+experiments.">Reply to "Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments.</a> Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).</li><li>Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Zinc+Clasp+Structure+Tethers+Lck+to+T+Cell+Coreceptors+CD4+and+CD8.">A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8.</a> Science. 301, 1725-1728 (2003).</li><li>Ramm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+screening:+a+technology+in+transition.">Image-based screening: a technology in transition.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).</li><li>Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+for+quantitative+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).</li><li>Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein-protein+interactions+in+the+live+cell+plasma+membrane+by+quantifying+prey+redistribution+upon+bait+micropatterning.">Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning.</a> Methods in Enzymology. , .</li></ol>

הסרטון מכיל תמונות סופקו על ידי אולימפוס, שנלקחו הבית של מעבדת המחקר של ויזואליזציה, אוניברסיטת בראון או לשכפל מ (Kim et al., 2003).

הסרטון מלווה מדגים שיטה לאיתור חלבונים אינטראקציות קרום הפלזמה של תאים חיים (Schwarzenbacher et al, 2008;. Brameshuber et al, 2009;.. Weghuber et al, in press). בעיקרון, כל פלטפורמה מבוססת מיקרוסקופיה TIRF יכול לשמש כמערכת readout. רק כאשר רגישות גבוהה הוא הרצוי (למשל לצורך זיהוי של מולקולות בודדות), מיקרוסקופים מתקדמים יידרש. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר בנקודות קריטיות הבאה במהלך תהליך ההכנה דורש תשומת לב מיוחדת: <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cy5 מניות חנות פתרון בתנאים כהה, כדי למנוע הלבנת של fluorophore ולהכין את BSA-Cy5 פתרון לעבוד טרי לפני הדפסת microcontact. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היזהר שלא לשרוט את micropattern על PDMS עם קצה פיפטה ו דגירה המדגם בתנאים כהה, כדי למנוע הלבנת של fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את coverslip על משטח סטרילי כדי למנוע הידבקות של שקופיות הזכוכית כדי בצלחת פטרי. לאחר חותמת PDMS דבק כדי להחליק את הזכוכית, לא להזיז אותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע בועות אוויר בתא התגובה דגירה המדגם בתנאים כהה, כדי למנוע הלבנת של fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תתנו המדגם יבש במשך יותר מ 2 דקות, כדי למנוע היווצרות של גבישי מלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ניתוק של התאים לא משתמשים טריפסין כפי לדבוק הרצון תחום תאי של חלבונים בממברנה ביטוי עד כה. הימנעות טריפסין יהיה מועיל חלבונים עם תחלופה נמוכה כדי ליצור micropatterns מיד לאחר ההתקשרות של תאים על פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפיקוח על מספר התאים מודגרות במיקרוסקופ ולוודא כי התאים אינם מגיעים יותר מ 30-50 מפגש%. ודא כי תאים מופרזת יוסרו לאלתר בשל המצורף מהירה של תאים על פני השטח נוגדן מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות רק עם איכות גבוהה-BSA Cy5 דפוסי ניתן להשתמש לצורך ניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הביטוי יציבה של חלבון פלואורסצנטי טרף עדיפה בשל מספר גדול יותר של תאים ניתן לנתח לכל סריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאמה נאותה TIRF היא הכרחית כדי להמחיש דפוסי בשל הרקע cytosolic. </li></ol> הטכניקה מיקרו דפוסים מציע מספר אפשרויות לניתוח אינטראקציות בין חלבונים. ראשית, יחד עם כימות של המקומיים, חלבונים אינטראקציות החליט מרחבית גם זיהוי של אינטראקציות חלשות או עקיף אפשרי בלי החיסרון של מתן מספר גבוה של תוצאות חיוביות או שליליות שגויות. שנית, היא מאפשרת לנתח חוקר חלבונים אינטראקציות קרום הפלזמה של תאים חיים, אשר קשה להשיג באמצעות גישות ביוכימיות כמו מסך 2-היברידית. שלישית הגישה מאפשרת זיהוי של הפיתיון טרף אינטראקציות כי הם מווסתת על ידי שינויים סביבתיים כמו טמפרטורה, נוכחות של חלבונים שונים או מולקולות אחרות או שלאחר translational שינויים. לפיכך assay מאפשר מאפננים ההקרנה של זוג אינטראקציה נתון בהקשר של תאים חיים. יתר על כן, על ידי הקטנת צפיפות השטח של ליגנד ללכוד או שימוש ligands חד ערכי, ניתוח של מצב המנוחה הופך אפשרי. לבסוף, אם פלטפורמות סריקה נאותה משמשים, את מספר התאים ניתח גבוה מספיק כדי להתאים לדרישות תפוקה גבוהה של חברות התרופות להקרנה סמים (Ramm, 2005).

in-vivo detection of protein-protein interactions on micro-patterned surfaces

להתיר את רשת אינטראקציה של מולקולות<em&gt; ב-vivo</em&gt; היא המפתח להבנת המנגנונים המווסתים את תפקוד התא וחילוף חומרים. שפע של אפשרויות מתודולוגי לטיפול אינטראקציות מולקולריות בתאים פותחו, אבל רוב השיטות האלה סובלים להיות עקיפה ולא כמותית ולכן בקושי. להיפך, כמה-high-end גישות כמותיות הוכנסו, אשר עם זאת קשה להאריך תפוקה גבוהה. כדי לשלב יכולות התפוקה גבוהה עם אפשרות לחלץ מידע כמותי, אנו לאחרונה פיתחו תפיסה חדשה לזיהוי חלבונים אינטראקציות (Schwarzenbacher<em&gt; ואח&#39;</em&gt;. 2008). כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לתכנון ובנייה של מערכת זו אשר מאפשרת לניתוח אינטראקציות בין חלבון-fluorophore שכותרתו (&quot;טרף&quot;) לבין חלבון קרום (&quot;פיתיון&quot;)<em&gt; ב-vivo</em&gt;. תאים הם מצופה על משטחים micropatterned פונקציונליות עם נוגדנים כנגד תחום exoplasmic את הפיתיון. Bait-טרף אינטראקציות הם assayed באמצעות חלוקה מחדש של הטרף ניאון. השיטה מתאפיינת ברגישות גבוהה עד לרמה של מולקולות בודדות, את היכולת לזהות אינטראקציות חלשות, יכולת תפוקה גבוהה, מה שהופך אותו רלוונטי ככלי מיון.

Watch this Scientific Journal Video about In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces at JoVE.com

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

וידאו זה מראה ניסויים עם ניתוח בדיעבד של חלבונים אינטראקציות על ידי שימוש במיקרו בדוגמת משטחים. הגישה מציעה את האפשרות לזהות אינטראקציות חלבון בתאים חיים, והוא משלב יכולות התפוקה גבוהה עם אפשרות לחלץ מידע כמותי.

In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Research

JoVE Journal

Biology

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-יוביקוויטין ממברנה שמרים בהתבסס שני היברידי (מיתוס) מערכת: כלי רב עוצמה עבור זיהוי חלבונים אינטראקציות

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

ב כימות vivo של G מצמידים חלבון קולטן אינטראקציות באמצעות נפתר Spectrally שני פוטון מיקרוסקופית

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

פיתוח של מעכבי חלבונים אינטראקציות דרך להחליף: בקשה לעיצוב ומעכבי CDK התחרותי הפיתוח ללא ATP

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א ארבידופסיס<em&gt; In vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...