Name: in-vivo detection of protein-protein interactions on micro-patterned surfaces
Uploaded: 2010-03-19T17:30:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces at JoVE.com

Biz GPI-GFP, hCD71 GFP inşa ve Daniel Legler, Konstanz Üniversitesi, İsviçre, onu türlü yardım, Katharina Strub, İsviçre&#39;nin Cenevre Üniversitesi Quentina Beatty, Linz, Avusturya Üniversitesi, teşekkür etmek istiyorum -DAF inşa. Avusturya Federal Bilim ve Araştırma Bakanlığı GEN-AU projesi; Bu çalışma, Avusturya Bilim Fonu&#39;nun (proje Y250-B03 FWF) tarafından desteklenmiştir.

Microcontact Baskı: <ol><li> Bir neşter kullanılarak PDMS damga micropattern alan Kes </li><li> Etanol (% 100) ve distile su ile püskürtülerek micropattern içeren alan yıkayın. </li><li> PDMS damga azot veya argon gazı ile kurulayın. </li><li> Pipet 50 ul BSA Cy5 çalışma solüsyonu (0.67 mg / ml) tüm micropattern alanında çözüm ile kaplıdır, böylece PDMS damga üzerine. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li><li> Fosfat ile kızarma micropattern alanında yıkayın Tamponlu Salin (PBS) ve distile su. </li><li> PDMS azot veya argon gazı ile kurulayın. </li><li> Ortasında bir epoksi kaplı lamel üzerine kendi ağırlığı altında PDMS damga yerleştirin ve petri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li><li> Lamel arka PDMS damga pozisyon Etiket ve bir forseps ile slayt damga şerit. </li><li> Çubuk lamel microcontact baskılı alan üzerinde Güvenli Seal Hibridizasyon odasına. Etiket alanın merkezinde lokalize etmek yardımcı olur. </li><li> Pipet 60 ul streptavidin tepki odasına çözüm (50 mg / ml) ve örnek oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin. </li><li> Örnek odasının içine tampon bir bağlantı noktası ekleyerek ve bir pompa ile ikinci bağlantı noktasına aynı anda çıkarmadan 1 ml PBS ile yıkayın. </li><li> Pipet 60 ul biotinlenmiş antikor işi çözüm (10 mg / ml% 0.1 Tween 20 ile desteklenmiş PBS &quot;PBST&quot;) reaksiyon odası ve oda sıcaklığında 60 dakika inkübe içine. </li><li> Örnek, odanın içine tampon bir bağlantı noktası ekleyerek ve bir pompa ile ikinci limanda tekrar kaldırarak 1 ml PBST ve daha sonra 1 ml PBS ile yıkayın. </li><li> Micropatterned yüzeyleri PBS içinde hücre ekimi için hazır olana kadar oda sıcaklığında karanlıkta saklayın. </li></ol> Micropatterned yüzeye hücrelerin inkübasyonu: <ol><li> % 50, 3 cm doku kültürü plaka izdiham yapışık hücrelerin büyümesine. </li><li> Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) solüsyonu ile ilgi yem ve av proteinleri ifade hücreleri ayırın ve 1,000 rpm&#39;de 5 dakika santrifüj. </li><li> Süpernatantı atın ve hücre pelletini göre büyüme ortamında çözülür. </li><li> 1000 rpm&#39;de 5 dakika santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı atın ve uygun büyüme ortamında hücre pelletini çözülür. </li><li> Exchange hücre süspansiyonu 60 ul micropatterned lamel reaksiyon odasından PBS. </li><li> Distile su ile ıslatma ve steril bir ped, kuru çalışmasını örnek önlemek için petri içine koyarak nemlendirilmiş bir oda oluşturun. </li><li> 37-gece boyunca hücreler inkübe ° C micropatterned yüzeyler% 5 CO 2 atmosfer. </li><li> Hücrelerin mikroskop analiz etmeden önce, Ca 2 de dahil olmak üzere Hank tamponlu tuz çözeltisi orta alışverişinde + ve Mg 2 +. </li></ol> Mikroskopi: <ol><li> Lamel uygun bir montaj yerleştirilir ve hücre morfolojisi, beyaz ışık altında kontrol edilir. </li><li> BSA Cy5, desen kalitesi, 647 nm dalga boyunda eksitasyon tarafından kontrol edilir. </li><li> Toplam İç Yansıma (TIR) ​​uyarma altında 488 veya 514 nm&#39;de, floresan av proteininin (GFP veya YFP) Micropatterns kaydedilir. </li></ol> Temsilcisi sonuçları: Hedef proteinlere micropatterned bir yüzey üzerinde yetiştirilen hücreler arasındaki etkileşimi varsa, av yem yeniden dağıtılması takip edecektir. Micropattern av proteinin floresan etiketi ile görüntülendi olabilir. Önemlisi kontrast elde edilen doğrudan bir etkileşim gücü ölçümü (bkz. Şekil 1) sağlar. Bu nedenle iki proteinin etkileşimi basit bir değerlendirme mümkün olur daha ölçülen birincil veri işleme gerek kalmadan. <img src="/files/ftp_upload/1969/1969fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 farklı etkileşim güçlü canlı hücre plazma membranı yem yeniden düzenlenmesi. CD59-antikor microbiochips TIR T24 hücrelerinin CD71-antikor (a) CD71-GFP ile transfekte görüntüleri, (b) CD4 ve CD4-antikor sitozolik YFP ve (c) GPI-GFP-DAF gösterilmiştir. Veriler için karakteristik olan güçlü (a), (b) veya Zayıf etkileşim (c). (A), (Weghuber ve ark. Baskıda), (b) (Schwarzenbacher ve ark, 2008) yeniden .

<ol>
	<li>Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reply+to+"Uncoupling+diffusion+and+binding+in+FRAP+experiments.">Reply to "Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments.</a> Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).</li><li>Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Zinc+Clasp+Structure+Tethers+Lck+to+T+Cell+Coreceptors+CD4+and+CD8.">A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8.</a> Science. 301, 1725-1728 (2003).</li><li>Ramm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+screening:+a+technology+in+transition.">Image-based screening: a technology in transition.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).</li><li>Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+for+quantitative+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).</li><li>Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein-protein+interactions+in+the+live+cell+plasma+membrane+by+quantifying+prey+redistribution+upon+bait+micropatterning.">Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning.</a> Methods in Enzymology. , .</li></ol>

Görselleştirme Araştırma Lab ana alınan Olympus, Brown Üniversitesi tarafından sağlanan veya (Kim ve ark, 2003) çoğaltılamaz video görüntüleri içerir.

İlişikteki video canlı hücrelerin plazma zarı (Brameshuber ve diğerleri, 2009;. Weghuber ve arkadaşları, basın Schwarzenbacher ve ark, 2008) protein-protein etkileşimleri tespit etmek için bir yöntem gösteriyor. Prensip olarak, herhangi bir TIRF tabanlı mikroskobu platformu okuma sistemi olarak kullanılacak. Yüksek hassasiyeti (örneğin tek moleküllerin tespiti için) istenen zaman, gelişmiş mikroskoplar gerekecektir. En iyi sonuçlar, hazırlanması sürecinde aşağıdaki kritik noktaları elde etmek için özel bir dikkat gerektirir: <ol class="lroman"><li> Karanlık koşullar altında saklayın Cy5 stok solüsyonu fluorofor beyazlatma önlemek ve microcontact yazdırmadan önce taze BSA Cy5 çalışma solüsyon hazırlanır. </li><li> PDMS micropattern pipet ucu ile kazıyın ve örnek fluorofor beyazlatma önlemek için karanlık koşullar altında inkübe için dikkatli olun. </li><li> Petri cam slayt yapışmasını önlemek için steril bir ped lamel koyun. Cam slayt PDMS damgası yapıştırılır sonra, hareket etmez. </li><li> Reaksiyon odasındaki hava kabarcıkları kaçının ve fluorofor beyazlatma önlemek için karanlık koşullar altında örnek kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Tuz kristallerinin oluşumunu önlemek için, fazla 2 dakika için örnek kurumasını bekleyin. </li><li> Hücrelerin ayrılmasına olarak tripsin kullanmayın tutunmaya şimdiye kadar ifade membran proteinlerinin ekstrasellüler etki alanı olacaktır. Yüzeyindeki hücrelerin ek hemen sonra micropatterns oluşturmak için düşük devir hızı ile proteinler tripsin kaçınmak yararlı olacaktır. </li><li> Mikroskop inkübe hücrelerinin sayısını kontrol ve hücrelerin% 30-50 daha fazla izdiham ulaşmak olmadığını emin olun. Aşırı hücrelerin antikor kaplı yüzey hücreleri hızlı eki nedeniyle hemen çıkarılmış olduğundan emin olun. </li><li> Sadece yüksek kaliteli BSA-Cy5 desen slayt ileri analiz için kullanılabilir. </li><li> , Floresan av protein Kararlı ifade tarama başına analiz edilebilir hücreleri daha fazla sayıda nedeniyle tercih edilir. </li><li> Yeterli TIRF ayarlaması nedeniyle desen sitozolik arka plan görselleştirmek için vazgeçilmez bir unsurdur. </li></ol> Mikro-desenleme tekniği, protein-protein etkileşimleri analiz için çeşitli olanaklar sunmaktadır. Öncelikle, aynı zamanda yerel, mekansal çözüme protein-protein etkileşimleri miktarının birlikte, yanlış pozitif veya negatif, yüksek bir sayı vermenin dezavantaj olmaksızın, zayıf ya da dolaylı etkileşimleri algılama mümkündür. İkincisi 2-hibrit ekran gibi biyokimyasal yaklaşımlarla elde etmek zor canlı hücrelerin plazma zarı, protein-protein etkileşimleri analiz etmek için araştırmacı sağlar. Üçüncü yaklaşım, sıcaklık, farklı proteinlerin veya diğer molekülleri ya da post-translasyonel modifikasyonlar varlığı gibi çevresel değişiklikler modüle yem-av etkileşimlerinin tespiti için izin verir. Bu nedenle tahlil canlı hücreleri bağlamında belirli bir etkileşim çiftinin tarama modülatörleri sağlar. Ayrıca, yakalama ligand veya monovalan ligandların kullanımı yüzey yoğunluğu azaltarak, dinlenme devlet analizi mümkün hale gelir. Son olarak, yeterli tarama platformlarda kullanılması halinde, analiz hücrelerinin sayısı, ilaç firmaları, ilaç tarama için yüksek kapasiteli talepleri (Ramm, 2005) maç için yeterince yüksek.

in-vivo detection of protein-protein interactions on micro-patterned surfaces

Moleküllerin etkileşim ağı çözülüyor<em&gt; In vivo</em&gt; Hücre fonksiyonu ve metabolizmayı düzenleyen mekanizmalar anlamanın anahtarıdır. Hücrelerin moleküler etkileşimler adresleme için metodolojik seçenekleri bir çok gelişmiş, ancak bu yöntemlerin çoğu oldukça dolaylı ve hemen hemen kantitatif nedenle muzdarip olmuştur. Aksine, birkaç high-end nicel yaklaşımlar getirilmiştir, ancak yüksek işlem hacmi genişletmek için zor olan. Kantitatif bilgileri ayıklamak imkanı ile yüksek verimlilik özellikleri birleştirmek için, yakın zamanda protein-protein etkileşimleri tanımlamak için yeni bir konsept geliştirdi (Schwarzenbacher<em&gt; Ve ark.</em&gt;, 2008). Burada, (&quot;yem&quot;) fluorofor-etiketli bir protein (&quot;av&quot;) ve bir membran proteini arasındaki etkileşimleri analiz etmek için izin verir Bu sistemin tasarımı ve yapımı için ayrıntılı bir protokol tarif<em&gt; In vivo</em&gt;. Hücreler yem exoplasmic etki alanına karşı antikorlar ile Fonksiyonlu micropatterned yüzeylerde kaplama. Bait-av etkileşimleri floresan yırtıcı yeniden dağıtımı yoluyla test. Bu yöntem, tarama aracı olarak uygulanabilir, tek moleküllerin düzeyini yüksek hassasiyet, zayıf etkileşimleri tespit yeteneği ve yüksek verimlilik kapasitesi ile karakterizedir.

Watch this Scientific Journal Video about In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces at JoVE.com

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Bu video kullanımı ile mikro-desenli yüzeyler, protein-protein etkileşimleri sonraki analizi ile deneyler gösterir. Bu yaklaşım, canlı hücreler protein etkileşimleri tespit etmek imkanı sunar ve kantitatif bilgileri ayıklamak imkanı ile yüksek verimlilik özellikleri bir araya getiriyor.

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Research

JoVE Journal

Biology

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Dayalı Membran Maya İki Hybrid (MİT) Sistemi: protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için güçlü bir araç

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

Işıksal Çözülmüş İki foton Mikroskop kullanarak G Protein Coupled Reseptör Etkileşmeleri in vivo Niceleme

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

Aracılığıyla DEĞİŞTİR Protein-protein etkileşimleri İnhibitörlerinin Geliştirilmesi: Tasarım ve Geliştirme Olmayan ATP Rekabetçi CDK inhibitörleri Uygulama

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...