Name: analysis of gene expression in emerald ash borer (agrilus planipennis) using quantitative real time-pcr
Uploaded: 2010-05-04T17:00:00
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Reconhecemos a ajuda fornecida por Lourdes Delta Arrueta Antequera (Departamento de Entomologia, Ohio State University / OARDC, Wooster, OH) na instalação dos experimentos. Agradecemos ao Dr. Therese Polónia (USDA, Serviços Florestais, NRS) para enviar amostras EAB larval. Ajuda fornecida pelo Dr. Luis Um Canas e Nuris M Acosta com a configuração do microscópio é apreciado. O financiamento para este projeto foi fornecido pelo Estado e Federal fundos apropriados para o Ohio Agricultural Research e Development Center, The Ohio State University.

O protocolo completo, com diferentes passos é descrito no fluxograma na Figura 1. Medidas individuais que constituem a dissecação, extração de RNA, a síntese de cDNA e Strand Primeiro qRT-PCR são detalhados abaixo. I. Dissecção larval <ol><li> Antes do início deste procedimento, coloque broca cinzas Emerald, ou EAB, larvas com papel de filtro úmido, até dissecções são executadas. Mantenha recém-fosfato preparado 1X solução salina, ou PBS, em gelo para manter o frio em tod...

<ol>
	<li>Lehane, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritrophic+matrix+structure+and+function.">Peritrophic matrix structure and function.</a> Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).</li><li>Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cDNA+cloning+and+transcriptional+expression+of+a+peritrophin-like+gene+in+the+Hessian+fly,+Mayetiola+destructor+[Say].">cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say].</a> Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).</li><li>Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+of+the+midgut+transcriptome+of+the+poplar+leaf+beetle+Chrysomela+tremulae+reveals+new+gene+families+in+Coleoptera.+Ins+Bio+and+Mol.">Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol.</a> 39, 403-413 (2009).</li><li>Pfaffl, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).</li><li>Tellam, R. L., Lehane, M. J., Billingsley, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of the Insect Midgut. , 86-114 (1996).</li></ol>

Os ciclos de limiar (Ct) valor é obtido para cada amostra na placa de qRT-PCR. Para fazer a curva padrão, o valor de Ct obtidos para cada diluição foi em função do log da sua concentração. Os valores de Ct para as amostras experimentais foram então desenhados para esta curva padrão de diluição em série. Quantidades alvo foram calculados a partir de distintas curvas padrão gerada para cada tecido ou seja, experiência e expressão de desenvolvimento. Os valores de expressão relativa (REVs) foram, então, d...

analysis of gene expression in emerald ash borer (agrilus planipennis) using quantitative real time-pcr

Emerald broca de cinzas (EAB,<em&gt; Agrilus planipennis</em&gt;) É uma praga exótica invasora, que já matou milhões de árvores de cinzas (<em&gt; Fraxinus</em&gt; Spp) na América do Norte.<strong&gt;</strong&gt; EAB continua a se espalhar rapidamente e ataques de cinzas árvores de diferentes idades, a partir de mudas de árvores maduras. No entanto, até à data pouco ou nenhum conhecimento molecular existe para EAB. Estamos interessados ​​em decifrar os processos moleculares baseados fisiológicas ao nível do tecido que EAB ajuda na colonização bem sucedida de freixos. Neste relatório, nós mostramos o uso eficaz dos quantitativos PCR em tempo real (qRT-PCR) para verificar os níveis de mRNA em diferentes tecidos larval (incluindo intestino, gordura corpos e cutícula) e diferentes estágios de desenvolvimento (incluindo 1<sup&gt; St</sup&gt; -, 2<sup&gt; Nd</sup&gt; -, 3<sup&gt; Rd</sup&gt; -, 4<sup&gt; Th</sup&gt;-Prepupas estádios e adultos) da EAB. Como exemplo, um gene peritrophin (doravante,<em&gt; AP-PERI1</em&gt;) É exemplificado como o gene de interesse e uma proteína ribossomal (<em&gt; AP-RP1</em&gt;) Como o controle interno. Peritrophins são componentes importantes da membrana peritrófica / matriz (PM), que é o revestimento do intestino do inseto. A PM tem diversas funções, incluindo a digestão e proteção mecânica ao epitélio do intestino médio.

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Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitativas PCR em tempo real (qRT-PCR) é uma ferramenta eficaz para diagnosticar os níveis de mRNA nos tecidos do inseto e estágios diferentes de desenvolvimento. Neste relatório, nós mostramos o uso de qRT-PCR para verificar os níveis de mRNA em diferentes tecidos e estágios de desenvolvimento larval das espécies de insetos invasivos, esmeralda broca cinzas.

Análise de Expressão Gênica em Emerald Borer Ash ( Agrilus planipennis) Usando Quantitativa em Tempo Real-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays

Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Análise da expressão global de Gene usando uma plataforma Microarray Zebrafish Oligonucleotide

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Quantitativas Real-Time PCR usando o Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Perfil dos pré-micro RNAs e microRNAs usando Quantitative PCR em tempo real (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determinar perfis de expressão genética em C. elegans Usando Microarray e PCR em tempo real

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...