Name: t-wave ion mobility-mass spectrometry: basic experimental procedures for protein complex analysis
Uploaded: 2010-07-31T17:00:00
Duration: 16 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis at JoVE.com

De auteurs bedanken de Sharon leden van de groep voor hun kritische review, en voor hun bijdrage aan het manuscript. We zijn dankbaar voor de steun van de Morasha en Bikura Programma&#39;s, de Israel Science Foundation (Grant nrs. 1823-1807 en 378/08), de Josef Cohn Minerva Centrum voor biomembraan onderzoek, de Chais Family Fellows Program voor New Scientists, de Abraham en Sonia Rochlin Foundation; de Wolfson Family Charitable Trust, het Helen en Milton A. Kimmelman Centrum voor Biomoleculaire Structuur en assemblage, het landgoed van Shlomo en Sabine Beirzwinsky; Meil ​​de Botton Aynsley, en Karen Siem, Verenigd Koninkrijk.

<ol>
	<li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility-mass+spectrometry+analysis+of+large+proteincomplexes.">Ion mobility-mass spectrometry analysis of large proteincomplexes.</a> Nat Protoc. 3 (7), 1139-1152 (2008).</li><li>Scarff, C. A., Thalassinos, K., Hilton, G. R., Scrivens, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Travelling+wave+ion+mobility+mass+spectrometry+studies+of+protein+structure:+biological+significance+and+comparison+with+X-ray+crystallography+and+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+measurements.">Travelling wave ion mobility mass spectrometry studies of protein structure: biological significance and comparison with X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance spectroscopy measurements.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (20), 3297-3304 (2008).</li><li>Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+drift+time+measurements+from+travelling+wave+ion+mobility+spectrometry-mass+spectrometry+studies.">Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies.</a> Eur J Mass Spectrom (Chichester, Eng). 15 (2), 113-130 (2009).</li><li>Leary, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+measuring+conformation+of+solvent-disrupted+protein+subunits+using+T-WAVE+ion+mobility+MS:+an+investigation+into+eukaryotic+initiation+factors.">Methodology for measuring conformation of solvent-disrupted protein subunits using T-WAVE ion mobility MS: an investigation into eukaryotic initiation factors.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 20 (9), 1699-1706 (2009).</li><li>Lorenzen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+stoichiometry+and+conformational+changes+in+the+first+step+of+the+P22+tail+assembly.">Determination of stoichiometry and conformational changes in the first step of the P22 tail assembly.</a> J Mol Biol. 379 (2), 385-396 (2008).</li><li>Pukala, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+architecture+of+multiprotein+assemblies+determined+using+restraints+from+gas-phase+measurements.">Subunit architecture of multiprotein assemblies determined using restraints from gas-phase measurements.</a> Structure. 17 (9), 1235-1243 (2009).</li><li>van Duijn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperonin+complexes+monitored+by+ion+mobility+mass+spectrometry.">Chaperonin complexes monitored by ion mobility mass spectrometry.</a> J Am Chem Soc. 131 (4), 1452-1459 (2009).</li><li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+macromolecular+protein+rings+in+the+absence+of+bulk+water.">Evidence for macromolecular protein rings in the absence of bulk water.</a> Science. 310 (5754), 1658-1661 (2005).</li><li>Ruotolo, B. T., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+of+native+proteins+are+retained+in+vacuum.">Aspects of native proteins are retained in vacuum.</a> Curr Opin Chem Biol. 10 (5), 402-408 (2006).</li><li>Giles, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+a+travelling+wave-based+radio-frequency-only+stacked+ring+ion+guide.">Applications of a travelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (20), 2401-2414 (2004).</li><li>McKay, A. R., Ruotolo, B. T., Ilag, L. L., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+measurements+of+increased+accuracy+resolve+heterogeneous+populations+of+intact+ribosomes.">Mass measurements of increased accuracy resolve heterogeneous populations of intact ribosomes.</a> J Am Chem Soc. 128 (35), 11433-11442 (2006).</li><li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility-mass+spectrometry+reveals+long-lived,+unfolded+intermediates+in+the+dissociation+of+protein+complexes.">Ion mobility-mass spectrometry reveals long-lived, unfolded intermediates in the dissociation of protein complexes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 46 (42), 8001-8004 (2007).</li><li>Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+virus+capsid+assembly+from+non-covalent+mass+spectrometry.">Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry.</a> Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).</li><li>Valentine, S. J., Counterman, A. E., Clemmer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+660+peptide+ion+cross+sections:+use+of+intrinsic+size+parameters+for+bona+fide+predictions+of+cross+sections.">A database of 660 peptide ion cross sections: use of intrinsic size parameters for bona fide predictions of cross sections.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 10 (11), 1188-1211 (1999).</li><li>Mesleh, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+information+from+ion+mobility+measurements:+effects+of+the+long-range+potential.">Structural information from ion mobility measurements: effects of the long-range potential.</a> J Phys Chem. 100, 16082-16086 (1996).</li><li>Shvartsburg, A. A., Jarrold, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+exact+hard-spheres+scattering+model+for+the+mobilities+of+polyatomic+ions.">An exact hard-spheres scattering model for the mobilities of polyatomic ions.</a> Chem Phys Lett. 261, 86-91 (1996).</li></ol>

Het protocol hier beschreven staat het definiëren van de botsing doorsnede van eiwitten of eiwitcomplexen met een onbekende driedimensionale structuur, met als doel het verstrekken van informatie over hun algemene vorm, subunit verpakking en topologie. Daartoe eens botsing doorsnede waarden worden weergegeven is het noodzakelijk om deze waarden om te zetten in structurele details. Dit proces vereist extra experimentele inspanningen en computationele analyse, die hieronder kort worden besproken. Om te beginnen, is het raadzaam om eiwitten of eiwitcomplexen te analyseren met bekende structuren. Deze metingen kunnen een nuttige kwaliteitscontrole van de methodologie en de nauwkeurigheid beoordeling van de verwerving parameters kunnen door het vergelijken van de theoretische en gemeten Ω waarden. De theoretische dwarsdoorsneden kunnen worden berekend op basis van de kristalstructuur coördineert het gebruik van de MOBCAL 15,16 software, die een open source FORTRAN gebaseerde software waardoor code editing afhankelijk van de operator nodig heeft. Voor het uitvoeren van dergelijke berekeningen is het noodzakelijk om het programma zodanig dat het aantal van iteratieve berekeningen die zijn uitgevoerd per ingang structuur is verhoogd en dat de coördinatie van bestanden met groot aantal atomen worden geaccepteerd 1 te wijzigen. Een IM-MS strategie voor het definiëren van topologische arrangementen van subeenheden binnen multicomponent assemblies is onlangs voorgesteld 4,6. Bij deze methode wordt de bewaking van dissociatie paden van verzamelingen van eiwitten tot kleinere componenten. Deze dissociatie wordt bereikt door gecontroleerde aanpassing van de oplossing voor de omstandigheden, die aanleiding geeft tot een verdeling van subcomplexes een afspiegeling is van de &quot;bouwstenen&quot; van de assemblages. De gelijktijdige meting van Ω waarden van zowel de intacte complexe en demontage producten genereert structurele beperkingen die vervolgens worden gebruikt voor het berekenen van topologische modellen van de eiwitcomplexen. Het uitgangspunt ten grondslag liggen aan deze methodiek is dat de gegenereerde subcomplexes hun moedertaal-achtige bevestigingen te behouden, ja en recente studies hebben aangetoond dat de oplossing structuur van de demontage producten gehandhaafd blijft en er geen grote herschikking in een van beide oplossing of gas fases hebben plaatsgevonden 4,6. De laatste stap in de toewijzing van quaternaire structuur om gas-fase-eiwit complex ionen is de montage van de botsing doorsnede waarden computer gegenereerde modellen. Modeling benaderingen zijn gebruikt om de verschillende mogelijke topologische arrangementen van subeenheden en hun in silico Ω worden berekend en vergeleken met de experimentele degenen te verkennen. Op dit moment slechts een paar computationele benaderingen worden gebruikt, zoals de spheretype grofkorrelige methode die de diameter van subeenheden 1,8 benadert. Over het geheel, dit gebied is nog in zijn vroege jaren en de verdere ontwikkeling nodig is om deze aanpak generiek, en toepasbaar op een breed scala van complexen.

t-wave ion mobility-mass spectrometry: basic experimental procedures for protein complex analysis

Ion mobiliteit (IM) is een methode die de tijd genomen voor een ion te reizen door middel van een druk cel onder invloed van een zwak elektrisch veld maatregelen. De snelheid waarmee de ionen doorkruisen de drift regio is afhankelijk van hun grootte: grote ionen een groter aantal botsingen ervaring met de achtergrond inert gas (meestal N 2) en dus reizen meer langzaam door de IM-apparaat dan de ionen die een kleinere vormen doorsnede. In het algemeen, de tijd die het duurt voor de ionen om te migreren hoewel de dichte gasfase scheidt hen, volgens hun botsing doorsnede (Ω). Onlangs werd IM spectrometrie gekoppeld aan massa spectrometrie en een reizende-wave (T-golf) Synapt ionen mobiliteit massaspectrometer (IM-MS) werd uitgebracht. Het integreren van massaspectrometrie met ion mobiliteit in staat stelt een extra dimensie van het monster scheiding en definitie, waardoor een drie-dimensionale spectrum (massa op te laden, de intensiteit en drift tijd). Deze scheiding techniek kan de spectrale overlap te verminderen, en maakt resolutie van heterogene complexen met zeer vergelijkbare massa, of massa-tot-lading ratio&#39;s, maar verschillende drift tijden. Bovendien is de drift tijd metingen geven een belangrijke laag van structurele informatie, zoals Ω is gerelateerd aan de totale vorm en topologie van het ion. De correlatie tussen de gemeten drift tijd waarden en Ω wordt berekend met behulp van een kalibratie-curve gegenereerd uit kalibratieoplossing eiwitten met gedefinieerde doorsneden 1. De kracht van de IM-MS aanpak ligt in zijn vermogen om het subunit verpakking en algemene vorm van de verzamelingen van eiwitten bij micromolaire concentraties te definiëren, en bijna-fysiologische omstandigheden 1. Verschillende recente studies IM van zowel individuele eiwitten 2,3 en niet-covalente eiwitcomplexen 4-9, met succes aangetoond dat eiwit quaternaire structuur behouden blijft in de gasfase, en benadrukt het potentieel van deze benadering in de studie van de verzamelingen van eiwitten van onbekende geometrie . Hier bieden wij een gedetailleerde beschrijving van de IMS-MS analyse van eiwitcomplexen met behulp van de Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd, de enige commerciële IM-MS instrument op dit moment beschikbaar) 10. Beschrijven we de basis optimalisatie stappen, de kalibratie van de botsing doorsneden, en methoden voor gegevensverwerking en interpretatie. De laatste stap van het protocol bespreekt methodes voor de berekening van de theoretische Ω waarden. Het geheel genomen, is het protocol geen poging om elk aspect van IM-MS karakterisering van verzamelingen van eiwitten te dekken, maar veeleer, haar doel is om de praktische aspecten van de methode te introduceren om nieuwe onderzoekers in het veld.

Watch this Scientific Journal Video about T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis at JoVE.com

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility-massaspectrometrie is een nieuwe gas-fase ionen technologie die scheidt, op basis van hun botsing doorsnede en massa. De methode biedt drie-dimensionale informatie over de algemene topologie en de vorm van eiwitcomplexen. Hier schetsen we een basisprocedure voor het instrument instellen en optimaliseren, kalibratie van drift tijden en data interpretatie.

T-wave Ion Mobility-massaspectrometrie: Basic Experimentele Procedures voor Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Monstervoorbereiding: de Ultra Thin Layer methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Homarus Americanus Stomatogastric Nervous System Dissection

Homarus Americanus Stomatogastric Nervous System Dissection

With the goal of understanding how nervous systems produce activity and respond to the environment, neuroscientists turn to model systems that exhibit the ...

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

Kanker Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

Bruto Dissectie van de maag van de Kreeft, Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Niet-invasieve In Vivo Small Animal MRI en MRS: Basic experimentele procedures

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Met behulp van de GELFREE 8100 Fractionering System for Molecular Weight-Based Fractionering met Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Het analyseren van grote eiwitcomplexen de Structuurfondsen massaspectrometrie

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

Bloedafname voor biochemische analyse bij volwassen zebravis

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

De MultiBac Protein Complex Production Platform in het EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...