Name: t-wave ion mobility-mass spectrometry: basic experimental procedures for protein complex analysis
Uploaded: 2010-07-31T17:00:00
Duration: 16 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis at JoVE.com

המחברים מודים לחברי הקבוצה שרון סקירה ביקורתית שלהם, על תרומתם כתב היד. אנו אסירי תודה על התמיכה של תוכניות מורשה ו ביכורה, הקרן הלאומית למדע (מענק מס &#39;1823-1807 ו - 378/08), יוסף כהן מרכז מינרבה לחקר Biomembrane, עמיתי משפחת צ&#39;ייס תכנית מדענים בניו, אברהם וסוניה Rochlin קרן; האמון משפחת וולפסון הצדקה; הלן מילטון א קימלמן המרכז מבנה Biomolecular ו העצרת; הנדל&quot;ן של שלמה סבין Beirzwinsky; Meil ​​דה בוטון Aynsley, וקארן סיאם, בריטניה.

<ol>
	<li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility-mass+spectrometry+analysis+of+large+proteincomplexes.">Ion mobility-mass spectrometry analysis of large proteincomplexes.</a> Nat Protoc. 3 (7), 1139-1152 (2008).</li><li>Scarff, C. A., Thalassinos, K., Hilton, G. R., Scrivens, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Travelling+wave+ion+mobility+mass+spectrometry+studies+of+protein+structure:+biological+significance+and+comparison+with+X-ray+crystallography+and+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+measurements.">Travelling wave ion mobility mass spectrometry studies of protein structure: biological significance and comparison with X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance spectroscopy measurements.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (20), 3297-3304 (2008).</li><li>Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+drift+time+measurements+from+travelling+wave+ion+mobility+spectrometry-mass+spectrometry+studies.">Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies.</a> Eur J Mass Spectrom (Chichester, Eng). 15 (2), 113-130 (2009).</li><li>Leary, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+measuring+conformation+of+solvent-disrupted+protein+subunits+using+T-WAVE+ion+mobility+MS:+an+investigation+into+eukaryotic+initiation+factors.">Methodology for measuring conformation of solvent-disrupted protein subunits using T-WAVE ion mobility MS: an investigation into eukaryotic initiation factors.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 20 (9), 1699-1706 (2009).</li><li>Lorenzen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+stoichiometry+and+conformational+changes+in+the+first+step+of+the+P22+tail+assembly.">Determination of stoichiometry and conformational changes in the first step of the P22 tail assembly.</a> J Mol Biol. 379 (2), 385-396 (2008).</li><li>Pukala, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+architecture+of+multiprotein+assemblies+determined+using+restraints+from+gas-phase+measurements.">Subunit architecture of multiprotein assemblies determined using restraints from gas-phase measurements.</a> Structure. 17 (9), 1235-1243 (2009).</li><li>van Duijn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperonin+complexes+monitored+by+ion+mobility+mass+spectrometry.">Chaperonin complexes monitored by ion mobility mass spectrometry.</a> J Am Chem Soc. 131 (4), 1452-1459 (2009).</li><li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+macromolecular+protein+rings+in+the+absence+of+bulk+water.">Evidence for macromolecular protein rings in the absence of bulk water.</a> Science. 310 (5754), 1658-1661 (2005).</li><li>Ruotolo, B. T., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+of+native+proteins+are+retained+in+vacuum.">Aspects of native proteins are retained in vacuum.</a> Curr Opin Chem Biol. 10 (5), 402-408 (2006).</li><li>Giles, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+a+travelling+wave-based+radio-frequency-only+stacked+ring+ion+guide.">Applications of a travelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (20), 2401-2414 (2004).</li><li>McKay, A. R., Ruotolo, B. T., Ilag, L. L., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+measurements+of+increased+accuracy+resolve+heterogeneous+populations+of+intact+ribosomes.">Mass measurements of increased accuracy resolve heterogeneous populations of intact ribosomes.</a> J Am Chem Soc. 128 (35), 11433-11442 (2006).</li><li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility-mass+spectrometry+reveals+long-lived,+unfolded+intermediates+in+the+dissociation+of+protein+complexes.">Ion mobility-mass spectrometry reveals long-lived, unfolded intermediates in the dissociation of protein complexes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 46 (42), 8001-8004 (2007).</li><li>Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+virus+capsid+assembly+from+non-covalent+mass+spectrometry.">Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry.</a> Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).</li><li>Valentine, S. J., Counterman, A. E., Clemmer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+660+peptide+ion+cross+sections:+use+of+intrinsic+size+parameters+for+bona+fide+predictions+of+cross+sections.">A database of 660 peptide ion cross sections: use of intrinsic size parameters for bona fide predictions of cross sections.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 10 (11), 1188-1211 (1999).</li><li>Mesleh, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+information+from+ion+mobility+measurements:+effects+of+the+long-range+potential.">Structural information from ion mobility measurements: effects of the long-range potential.</a> J Phys Chem. 100, 16082-16086 (1996).</li><li>Shvartsburg, A. A., Jarrold, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+exact+hard-spheres+scattering+model+for+the+mobilities+of+polyatomic+ions.">An exact hard-spheres scattering model for the mobilities of polyatomic ions.</a> Chem Phys Lett. 261, 86-91 (1996).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר להגדיר את לחצות קטע ההתנגשות של חלבונים או קומפלקסים חלבונים עם מבנה בעל שלוש ידועים ממדי, במטרה לספק מידע על הצורה הכללית שלהם, אריזה למקטע ו טופולוגיה. לשם כך פעם לחצות התנגשות ערכים סעיף מתוארים יש צורך להמיר את הערכים הללו כדי פרטים מבניים. תהליך זה דורש מאמצים נוספים ניסיוניים כמו גם ניתוח חישובית, אשר דנו בקצרה להלן. ראשית, מומלץ לנתח חלבונים או קומפלקסים חלבונים עם מבנים ידועים. מדידות אלה יכולים לספק בקרת איכות שימושי של המתודולוגיה ויאפשר הערכת הדיוק של הפרמטרים הרכישה על ידי השוואת התיאורטי נמדד בערכים Ω. אזורים התיאורטי חתך צלב ניתן לחשב מתוך המבנה הגבישי קואורדינטות באמצעות תוכנת MOBCAL 15,16, המהווה מקור פתוח תוכנה FORTRAN מבוסס קוד המאפשר עריכת בהתאם לצרכי המפעיל. עבור מפעיל חישובים כאלה הוא נדרש לשנות את התוכנית כך שמספר איטרטיבי חישובים שבוצעו לכל מבנה קלט הוא גדל וזה לתאם קבצים המכילים מספר גדול של אטומים מתקבלים 1. אסטרטגיה IM-MS להגדרת הסדרים טופולוגי של יחידות משנה בתוך multicomponent אסיפות הוצע לאחרונה 4,6. השיטה כרוכה ניטור של המסלולים דיסוציאציה של מכלולים חלבון לרכיבים קטנים יותר. דיסוציאציה זו מושגת באמצעות התאמה מבוקרת של התנאים שלב פתרון, אשר מעורר הפצה של subcomplexes רעיוני של &quot;אבני הבניין&quot; של מכלולים. מדידה בו זמנית של ערכים Ω של המתחם שניהם שלמים ומוצרי פירוק יוצרת מגבלות מבניות אשר משמשים לחישוב המודלים טופולוגי של קומפלקסים חלבונים. הנחת היסוד הבסיסית במתודולוגיה זו היא כי subcomplexes שנוצר לשמור אישורים מקומיים כמו שלהם, ואכן מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי המבנה פתרון של מוצרי פירוק נשמרת ואין התארגנות מרכזי פתרון או שלבים גז התרחשו 4,6. השלב האחרון במשימה של מבנה הרביעון לגז שלב יונים חלבון מורכב מתאים הצלב התנגשות ערכים סעיף מודלים מחשב. גישות מידול מועסקים על מנת לחקור את הסדרים שונים טופולוגי אפשרית של יחידות משנה שלהם ואת הערכים סיליקו Ω מחושבים לעומת אלה ניסיוני. נכון לעכשיו רק גישות חישוביות כמה משמשים, כמו שיטת גס גרגר spheretype המדמה את הקוטר של יחידות משנה 1,8. ככלל, תחום זה נמצא עדיין בשנים הראשונות שלה התפתחות נוספת נדרשת כדי להפוך את הגישה הזו גנריות, והיא חלה על מגוון רחב של קומפלקסים.

t-wave ion mobility-mass spectrometry: basic experimental procedures for protein complex analysis

יון ניידות (IM) היא שיטה אשר מודד את הזמן שנדרש עבור יון לנסוע דרך תא בלחץ תחת השפעה של שדה חשמלי חלש. המהירות שבה היונים חוצים את האזור להיסחף תלוי בגודל שלהם: יונים גדול יחוו מספר גדול יותר של התנגשויות עם גז אינרטי הרקע (בדרך כלל N 2) וכך לנסוע יותר לאט דרך המכשיר IM מאלו שמרכיבים יונים קטן יותר חתך. באופן כללי, הזמן שלוקח עבור היונים להעביר אף את השלב גז דחוס מפריד אותם, על פי ההתנגשות שלהם חתך (Ω). לאחרונה, IM ספקטרומטריית היה יחד עם ספקטרומטריית מסה נודדת גל (T-wave) Synapt יון ניידות ספקטרומטר מסה (IM-MS) שוחרר. שילוב ספקטרומטריית מסה עם ניידות יון המאפשרת מימד נוסף של הפרדה מדגם הגדרה, מניב מגוון תלת ממדי (מסה לעת תשלום, עוצמה, ואת להיסחף). טכניקה זו מאפשרת הפרדה חפיפה ספקטרלית לירידה, ומאפשר ברזולוציה של קומפלקסים הטרוגנית עם מסה דומה מאוד, או המסה תשלום יחסי, אבל פעמים להיסחף אחר. יתר על כן, מדידות זמן להיסחף לספק נדבך חשוב של מידע מבניים, כמו Ω קשורה בצורת טופולוגיה הכוללת של יון. המתאם בין זמן הערכים שנמדדו להיסחף Ω מחושב באמצעות עקומת כיול שנוצר חלבונים calibrant עם חתכים מוגדר 1. כוחה של גישה IM-MS טמונה ביכולתה להגדיר את האריזה למקטע ואת הצורה הכללית של מכלולים החלבון בריכוזים מיקרו, ו-near-פיזיולוגיים תנאים 1. מספר מחקרים IM האחרונות של שני חלבונים בודדים 2,3 ולא קוולנטיים קומפלקסים חלבונים 4-9, הפגינו בהצלחה כי מבנה החלבון הרביעון נשמר בשלב גז, הדגיש את הפוטנציאל של גישה זו במחקר של מכלולים חלבון הגיאומטריה לא ידוע . כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של ניתוח IMS-MS של קומפלקסים חלבונים באמצעות Synapt (quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) מכשיר HDMS (ווטרס בע&quot;מ; רק מכשיר מסחרי IM-MS זמין כרגע) 10. אנו מתארים את השלבים אופטימיזציה בסיסית, כיול של התנגשות חתכים, שיטות לעיבוד נתונים לפרשנות. השלב הסופי של פרוטוקול דן שיטות לחישוב תיאורטי ערכים Ω. באופן כללי, הפרוטוקול אינו מנסה לכסות כל היבט של אפיון IM-MS של מכלולים חלבון, אלא מטרתו היא להציג את ההיבטים המעשיים של שיטת לחוקרים חדשים בתחום.

Watch this Scientific Journal Video about T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis at JoVE.com

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

יון ניידות ספקטרומטריית מסה היא המתעוררים גז שלב טכנולוגיה שמפרידה יונים, המבוסס על ההתנגשות שלהם חתך ומסה. השיטה מספקת מידע תלת מימדי על טופולוגיה את הצורה הכוללת של קומפלקסים חלבונים. כאן, אנו המתאר הליך בסיסי לקביעת מכשיר ואופטימיזציה, כיול פעמים להיסחף, ופרשנות של נתונים.

גל T-Ion Mobility-ספקטרומטריית מסה: הפרוצדורות בסיסי לניתוח חלבונים מורכבים

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Homarus Americanus Stomatogastric Nervous System Dissection

Homarus Americanus Stomatogastric Nervous System Dissection

Homarus Americanus Stomatogastric Dissection מערכת העצבים

With the goal of understanding how nervous systems produce activity and respond to the environment, neuroscientists turn to model systems that exhibit the ...

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

סרטן Borealis מערכת העצבים Stomatogastric Dissection

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

Dissection ברוטו של קיבה של לובסטר, Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

פולשנית In vivo קטנים בעלי חיים MRI ו MRS: הפרוצדורות בסיסי

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

ניתוח מערכות חלבון גדול על ידי ספקטרומטריית מסה מבנית

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

הדם אוסף של ניתוח ביוכימי דג הזברה למבוגרים בלבד

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...