Name: t-wave ion mobility-mass spectrometry: basic experimental procedures for protein complex analysis
Uploaded: 2010-07-31T17:00:00
Duration: 16 min 40 s
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Os autores agradecem os membros do grupo Sharon para a sua revisão crítica, e por suas contribuições ao manuscrito. Estamos gratos pelo apoio dos Programas Morasha e Bikura, a Israel Science Foundation (Grant n. º s 378/08 e 1823-1807), o Josef Cohn Minerva Center for Research biomembrana, a Família Chais Fellows Program para novos cientistas, o Abraham e Sonia Rochlin Foundation, o Family Trust Wolfson Charitable, a Helen e Milton A. Kimmelman Centro de Estrutura Biomolecular e Montagem; o espólio de Shlomo e Beirzwinsky Sabine; Meil ​​de Botton Aynsley, e Karen Siem, Reino Unido.

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Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo aqui descrito permite definir a seção transversal de colisão de proteínas ou complexos de proteínas com uma estrutura de três desconhecidos dimensional, com o objetivo de fornecer informações sobre sua forma geral, embalagem subunidade e topologia. Para este efeito, uma vez valores colisão seção transversal são retratados é necessário converter esses valores para detalhes estruturais. Este processo requer esforços adicionais experimental bem como a análise computacional, que são brevemente discutidos abaixo. Para começar, recomenda-se a análise de proteínas ou complexos de proteínas com estruturas conhecidas. Estas medidas podem proporcionar um controle de qualidade útil da metodologia e permitirá avaliação da acurácia dos parâmetros de aquisição, comparando os valores teóricos e medidos Ω. O teórico áreas das secções transversais podem ser calculadas a partir da estrutura de cristal coordenadas usando o software MOBCAL 15,16, que é um software de código aberto baseado em FORTRAN que permite a edição de código de acordo com as necessidades do operador. Para a execução de tais cálculos é necessário modificar o programa de tal forma que o número de cálculos iterativos realizados por estrutura de entrada é maior e que os arquivos de coordenadas contendo grande número de átomos são aceitos 1. Uma estratégia IM-MS para a definição de arranjos topológicos de subunidades dentro multicomponentes montagens propôs recentemente 4,6. O método envolve o monitoramento de vias dissociação de grupos de proteínas para os componentes menores. Essa dissociação é conseguido através do ajuste das condições controladas fase de solução, que dá origem a uma distribuição de subcomplexes reflexivo da &quot;blocos de construção&quot; das assembléias. A medição simultânea de valores Ω de ambos os complexos intacta a desmontagem e produtos gera restrições estruturais que são então utilizados para calcular os modelos topológicos dos complexos de proteína. O pressuposto básico subjacente a esta metodologia é que o subcomplexes gerada reter seus nativos como confirmações, e na verdade estudos recentes têm demonstrado que a estrutura de solução dos produtos desmontagem é mantida e nenhum rearranjo importante em qualquer solução ou fases de gás têm ocorrido 4,6. O último passo na atribuição de estrutura quaternária de íons em fase gasosa em proteínas complexas é adequado a colisão valores seção transversal de modelos gerados por computador. Abordagens de modelagem são empregadas, a fim de explorar as diferentes possíveis arranjos topológicos de subunidades e seus valores em silico Ω são calculados e comparados com os experimentais. Atualmente, apenas algumas abordagens computacionais são usados, como o método de granulação grossa spheretype que se aproxima o diâmetro de 1,8 subunidades. No geral, este campo ainda está em seus primeiros anos e desenvolvimento é necessário para fazer essa abordagem genérica e aplicável a uma ampla gama de complexos.

t-wave ion mobility-mass spectrometry: basic experimental procedures for protein complex analysis

De mobilidade iônica (IM) é um método que mede o tempo necessário para um íon de viajar através de uma célula pressurizada sob a influência de um campo elétrico fraco. A velocidade pela qual os íons atravessam a região drift depende de seu tamanho: íons grandes vão experimentar um maior número de colisões com o gás de fundo inerte (geralmente N 2) e, assim, viajar mais devagar através do dispositivo de mensagens instantâneas do que os íons que compõem um menor cross-section. Em geral, o tempo que leva para os íons de migrar embora a fase de gás denso separa-los, de acordo com sua colisão transversal (Ω). Recentemente, a espectrometria de IM foi acoplado com espectrometria de massa e uma viagem-wave (onda T) Synapt de mobilidade iônica espectrômetro de massa (IM-MS) foi lançado. Integração de espectrometria de massa com mobilidade de íons permite uma dimensão extra de separação e definição da amostra, produzindo um espectro tridimensional (em massa para o tempo de carga, intensidade e drift). Esta técnica permite a separação de sobreposição espectral a diminuir, e permite a resolução de complexos heterogêneos com massa muito semelhante, ou massa-carga índices, mas os tempos drift diferentes. Além disso, as medidas de tempo deriva fornecer uma importante camada de informações estruturais, como Ω está relacionado com a forma geral e topologia do íon. A correlação entre os valores medidos drift tempo e Ω é calculada usando uma curva de calibração gerada a partir de proteínas de calibração definido com seções transversais 1. O poder da abordagem IM-MS reside na sua capacidade de definir a embalagem subunidade e forma geral das assembleias de proteína em concentrações micromolar, e quase fisiológica condições 1. Vários estudos recentes IM de ambas as proteínas individuais 2,3 e complexos não-covalente de proteínas 4-9, conseguiu demonstrar que a estrutura da proteína quaternária é mantida na fase gasosa, e destacou o potencial dessa abordagem no estudo dos conjuntos de proteínas de geometria desconhecida . Aqui, fornecemos uma descrição detalhada do IMS-MS análise de complexos de proteínas usando o Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrumento (Waters Ltd; o único instrumento IM-MS comerciais disponíveis atualmente) 10. Descrevemos os passos básicos de otimização, a calibração de colisão seções transversais, e métodos de processamento de dados e interpretação. A etapa final do protocolo discute métodos de cálculo dos valores teóricos Ω. No geral, o protocolo não tenta cobrir todos os aspectos do IM-MS caracterização de conjuntos de proteínas, mas sim, seu objetivo é apresentar os aspectos práticos do método para novos pesquisadores no campo.

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T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion espectrometria de mobilidade de massa é uma tecnologia emergente fase gasosa que separa íons, com base em sua colisão transversal e massa. O método fornece informações tridimensionais sobre a topologia geral e forma de complexos de proteínas. Aqui, descrevemos um procedimento básico para configuração e otimização de instrumento, calibração de vezes drift, e interpretação dos dados.

T-wave Ion Mobility Spectrometry massa: Basic Procedimentos para Análise Experimental Protein Complex

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