Name: photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells
Uploaded: 2010-06-26T23:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells at JoVE.com

<p class="jove_content"> Wij danken Mike W. Davidson (Florida State University) voor het leveren van plasmide DNA dat codeert voor fluorescerende eiwitten. Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health te verlenen GM72048 (tot DWP). </p>

<p class="jove_title"> 1. De voorbereiding van fluorescerend eiwit druppel monsters </p><p class="jove_content"> Een fluorescerend eiwit druppel monster bestaat uit een 1-octanol/water emulsie met de fluorescerende proteïne die woonachtig zijn in de waterfase. Deze emulsie is ingeklemd tussen een microscoop glijbaan en een 22 mm vierkant deksel glas voor microscopie toepassingen. </p><ol><li> Alvorens fluorescerend eiwit druppel monsters de microscoop dia&#39;s en dekglaasjes moeten worden schoongemaakt en bedekt met een hydrofobe agent. </li>...

<ol>
	<li>Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+in+orange+and+red+fluorescent+proteins.">Photoconversion in orange and red fluorescent proteins.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Methods</em>. <b>6</b>, 355-358 (2009).</li></ol>

<p class="jove_content"> Het gezuiverde fluorescerend eiwit druppel monster is een zeer handige sample-indeling voor de fotofysische karakterisering van fluorescerende eiwitten, bijvoorbeeld om te studeren fotobleken kinetiek en photoconversion kinetiek. De extreem kleine druppels volume (~ 20 picoliter) faciliteert fotobleken en photoconversion experimenten, die kan moeilijk zijn uit te voeren in de cuvette gebaseerde systemen. Daarnaast, zoals hier de druppel monster is bij uitstek geschikt voor het opzetten van een confocale microscoop voor ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microsope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR Scientific</td>
<td>48312-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22 mm cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>2940-245</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-octanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>O4500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>methyltrimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MatTek dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corp.</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-019</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells

<p class="jove_content"> Photoconvertible fluorescerende eiwitten (pc-KP&#39;s) zijn een klasse van fluorescerende eiwitten met &quot;optische highlighter&quot;-mogelijkheid, wat betekent dat de kleur van de fluorescentie kan worden veranderd door blootstelling aan licht van een specifieke golflengte. Optische highlighting maakt niet-invasieve markering van een subpopulatie van fluorescerende moleculen, en is daarom ideaal voor het opsporen van enkele cellen of organellen. </p><p class="jove_content"> Kritische parameters voor een efficiënte photoconversion zijn de intensiteit en de belichtingstijd van de photoconversion licht. Als de intensiteit te laag is, zal photoconversion worden langzaam of niet optreden op alle. Aan de andere kant kan te veel intensiteit of te lange blootstelling photobleach het eiwit en daardoor verminderen de efficiëntie van de photoconversion. </p><p class="jove_content"> Dit protocol beschrijft een algemene aanpak van het opzetten van een confocale laser scanning microscoop voor pc-FP photoconversion toepassingen. Eerst beschrijven we een procedure voor het bereiden van gezuiverde eiwit druppel monsters. Dit monster formaat is erg handig voor het bestuderen van de fotofysische gedrag van fluorescerende eiwitten onder de microscoop. Ten tweede, zullen we gebruik maken van de eiwit druppel monster te laten zien hoe de microscoop voor photoconversion configureren. En tot slot, laten we zien hoe de optische markering uit te voeren in levende cellen, inclusief dual-probe optische markeren met mOrange2 en Dronpa. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells at JoVE.com

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

<p class="jove_content">Dit protocol beschrijft een algemene aanpak voor photoconversion van fluorescerende eiwitten te voeren op een confocale laser scanning microscoop. We beschrijven de procedures voor de photoconversion van puried eiwit monsters, evenals voor dual-probe optische markeren in levende cellen met mOrange2 en Dronpa.</p>

Photoconversion van gezuiverde fluorescerende eiwitten en dual-probe optische markering in levende cellen

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Labeling stamcellen met fluorescente kleurstoffen voor niet-invasieve detectie met optische beeldvorming

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Een goede verzorging en reiniging van de microscoop

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

Phase Contrast en differentieel interferentie contrast (DIC) Microscopie

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Fluorescerende Labeling van COS-7 tot expressie SNAP-tag fusieproteïnen voor live cell imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in <em>Xenopus</em> Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Gepolariseerde Translocatie van fluorescerende eiwitten in<em> Xenopus</em> Ectoderm in reactie op Wnt signalering

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in <em>Drosophila</em> Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Imaging leven van GFP-gemerkte eiwitten in<em&gt; Drosophila</em&gt; Eicellen

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravitale Microscopy for Imaging Subcellulaire Structuren in Levende muizen die fluorescerende eiwitten

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

<em>In vivo</em> Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

<em>In vivo</em> Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Functionele Het oplossen en Channel activiteit Metingen van gezuiverde wildtype en mutante CFTR eiwit

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Karakterisering van calcificatie Events met Live optische en elektronenmicroscopie technieken in een Marine tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...