Name: photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells
Uploaded: 2010-06-26T23:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells at JoVE.com

<p class="jove_content"> Wir danken Mike W. Davidson (Florida State University) für die Bereitstellung von Plasmid-DNA, die fluoreszierende Proteine. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewähren GM72048 (zum DWP) unterstützt. </p>

<p class="jove_title"> 1. Vorbereitung des fluoreszierenden Proteins Tropfen Proben </p><p class="jove_content"> Ein fluoreszierendes Protein Tröpfchen Probe besteht aus einem 1-octanol/water Emulsion mit dem fluoreszierenden Protein mit Wohnsitz in der wässrigen Phase. Diese Emulsion wird zwischen einen Objektträger und ein 22 mm ² Deckglas für Mikroskopie-Anwendungen eingebettet. </p><ol><li> Bevor fluoreszierendes Protein Tropfen Proben der Objektträger und Deckgläser müssen gereinigt und mit einem hydrophoben Mittel beschichtet werd...

<ol>
	<li>Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+in+orange+and+red+fluorescent+proteins.">Photoconversion in orange and red fluorescent proteins.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Methods</em>. <b>6</b>, 355-358 (2009).</li></ol>

<p class="jove_content"> Das gereinigte fluoreszierendes Protein Tröpfchen Probe ist eine sehr bequeme Sample-Format für die photophysikalische Charakterisierung von fluoreszierenden Proteinen, zum Beispiel zu studieren photobleaching Kinetik und Photokonversion Kinetik. Die extrem kleinen Tröpfchen Volumen (~ 20 Picoliter) erleichtert Bleichen und Photokonversion Experimente, die schwierig sein, in Küvette basierten Systemen ausgeführt werden können. Darüber hinaus, da hier die Tröpfchen Probe ist ideal für den Aufbau eines konfokalen...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microsope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR Scientific</td>
<td>48312-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22 mm cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>2940-245</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-octanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>O4500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>methyltrimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MatTek dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corp.</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-019</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells

<p class="jove_content"> Photokonvertierbare fluoreszierende Proteine ​​(pc-FPs) sind eine Klasse von fluoreszierenden Proteinen mit &quot;optischen Hervorheben&quot;-Funktion, was bedeutet, dass die Farbe der Fluoreszenz durch Bestrahlung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge verändert werden kann. Optische Hervorhebung ermöglicht nicht-invasive Kennzeichnung einer Subpopulation von fluoreszierenden Molekülen, und ist daher ideal für die Verfolgung von einzelnen Zellen oder Organellen. </p><p class="jove_content"> Kritische Parameter für eine effiziente Photokonversion sind die Intensität und die Belichtungszeit der Photokonversion Licht. Wenn die Intensität zu niedrig ist, wird Photokonversion werden langsam oder gar nicht vorzukommen. Auf der anderen Seite kann zu viel Intensität oder zu lange Exposition photobleach des Proteins und somit die Verringerung der Effizienz des Photokonversion. </p><p class="jove_content"> Dieses Protokoll beschreibt einen allgemeinen Ansatz zur Einrichtung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop für PC-FP Photokonversion Anwendungen. Zunächst beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung gereinigtes Protein Tropfen Proben. Diese Sample-Format ist sehr praktisch für das Studium der photophysikalische Verhalten von fluoreszierenden Proteinen unter dem Mikroskop. Zweitens verwenden wir das Protein Tröpfchen Probe, um zu zeigen, wie man das Mikroskop für Photokonversion konfigurieren. Und schließlich werden wir zeigen, wie optische Hervorhebung in lebenden Zellen, einschließlich Dual-Sonde optische Hervorhebung mit mOrange2 und Dronpa durchzuführen. </p>

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Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

<p class="jove_content">Dieses Protokoll beschreibt einen allgemeinen Ansatz zur Photokonversion von fluoreszierenden Proteinen auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durchgeführt. Wir beschreiben Verfahren für die Photokonversion puried Protein-Proben, sowie für Dual-Sonde optische Hervorhebung in lebende Zellen mit mOrange2 und Dronpa.</p>

Photokonversion von gereinigtem fluoreszierende Proteine ​​und Dual-Sonde Optische Hervorhebung in lebenden Zellen

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Forschung

Biologie

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Richtige Pflege und Reinigung des Mikroskops

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

Phasenkontrast und Differential Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Fluoreszenzmarkierung von COS-7 mit dem Ausdruck SNAP-tag-Fusionsproteinen für das Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in <em>Xenopus</em> Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polarized Translokation von fluoreszierenden Proteinen in<em> Xenopus</em> Ektoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in <em>Drosophila</em> Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

<em>In vivo</em> Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

<em>In vivo</em> Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Charakterisierung von Verkalkungen Events Verwendung von Live-optische und Elektronenmikroskopie-Techniken in einem Marine-Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Photokonversion von gereinigtem fluoreszierende Proteine ​​und Dual-Sonde Optische Hervorhebung in lebenden Zellen

Photokonversion von gereinigtem fluoreszierende Proteine und Dual-Sonde Optische Hervorhebung in lebenden Zellen