Name: photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells
Uploaded: 2010-06-26T23:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells at JoVE.com

<p class="jove_content"> Agradecemos a Mike W. Davidson (Florida State University) para a prestação de DNA plasmídeo que codificam proteínas fluorescentes. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health conceder GM72048 (para DWP). </p>

<p class="jove_title"> 1. Preparação de amostras de gotículas proteína fluorescente </p><p class="jove_content"> Uma amostra de gota proteína fluorescente é constituída por uma emulsão 1-octanol/water com a proteína fluorescente que residem na fase aquosa. Esta emulsão está entre uma lâmina de microscópio e uma tampa de vidro 22 milímetros quadrados para aplicações de microscopia. </p><ol><li> Antes de fazer amostras de gotículas proteína fluorescente das lâminas e lamínulas de vidro devem ser limpas e revestidas com um agen...

<ol>
	<li>Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+in+orange+and+red+fluorescent+proteins.">Photoconversion in orange and red fluorescent proteins.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Methods</em>. <b>6</b>, 355-358 (2009).</li></ol>

<p class="jove_content"> A amostra purificada gota proteína fluorescente é um formato de amostra muito conveniente para a caracterização fotofísicas de proteínas fluorescentes, por exemplo para estudar fotobranqueamento cinética e cinética fotoconversão. O volume de gotículas extremamente pequenas (~ 20 picolitros) facilita a fotodegradação e experimentos fotoconversão, que pode ser difícil de executar em sistemas baseados cuvete. Além disso, como mostrado aqui a amostra de gota é ideal para a criação de um microscópio confoc...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microsope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR Scientific</td>
<td>48312-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22 mm cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>2940-245</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-octanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>O4500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>methyltrimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MatTek dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corp.</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-019</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells

<p class="jove_content"> Photoconvertible proteínas fluorescentes (pc-PQ) são uma classe de proteínas fluorescentes com &quot;óptica highlighter&quot; capacidade, o que significa que a cor da fluorescência pode ser alterada pela exposição à luz de um comprimento de onda específico. Destacando óptico não invasivo permite marcação de uma subpopulação de moléculas fluorescentes e, portanto, ideal para acompanhar uma única célula ou organelas. </p><p class="jove_content"> Parâmetros críticos para fotoconversão eficientes são a intensidade eo tempo de exposição da luz fotoconversão. Se a intensidade é muito baixa, fotoconversão será lento ou não ocorrer. Por outro lado, a intensidade ou exposição muito muito tempo pode photobleach a proteína e, assim, reduzir a eficiência do fotoconversão. </p><p class="jove_content"> Este protocolo descreve uma abordagem geral como configurar um microscópio laser confocal para aplicações pc-FP fotoconversão. Primeiro, vamos descrever um procedimento para a preparação de amostras de gotículas de proteína purificada. Este formato de amostra é muito conveniente para estudar o comportamento fotofísicas de proteínas fluorescentes sob o microscópio. Em segundo lugar, vamos usar o exemplo de gotículas de proteína para mostrar como configurar o microscópio para fotoconversão. E, finalmente, vamos mostrar como executar destacando óptica em células vivas, incluindo dual-sonda destacando óptica com mOrange2 e Dronpa. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells at JoVE.com

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

<p class="jove_content">Este protocolo descreve uma abordagem geral para realizar fotoconversão de proteínas fluorescentes em um microscópio confocal de varredura a laser. Descrevemos os procedimentos para a fotoconversão de amostras de proteínas puried, bem como para dual-sonda destacando ópticos em células vivas com mOrange2 e Dronpa.</p>

Fotoconversão de proteínas purificadas fluorescentes e Dual-sonda Destacando Optical em células vivas

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Biologia

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Cuidados e limpeza do microscópio

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

Contraste de fase e de interferência diferencial Contrast Microscopy (DIC)

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Labeling fluorescentes de COS-7 expressando as proteínas SNAP tag-Fusion para imagens de células vivas

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in <em>Xenopus</em> Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Translocação polarizada de proteínas fluorescentes em<em> Xenopus</em> Ectodérmicas em resposta à sinalização Wnt

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in <em>Drosophila</em> Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Imagens ao vivo de Proteínas GFP-rotulados em<em&gt; Drosophila</em&gt; Oócitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

<em>In vivo</em> Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

<em>In vivo</em> Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Caracterização de calcificação eventos usando o Live Óptica e Microscopia Eletrônica de técnicas em um tubeworm Marinha

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...