Name: photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells
Uploaded: 2010-06-26T23:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells at JoVE.com

<p class="jove_content"> Damos las gracias a Mike W. Davidson (Universidad Estatal de Florida) para proporcionar el plásmido de ADN que codifican las proteínas fluorescentes. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención GM72048 (a DWP). </p>

<p class="jove_title"> 1. Preparación de muestras de proteínas fluorescentes gota </p><p class="jove_content"> Una muestra de la proteína fluorescente consiste en gotas de una emulsión de 1-octanol/water con la proteína fluorescente que residían en la fase acuosa. Esta emulsión se encuentra entre un portaobjetos de microscopio y un vaso de 22 mm cuadrados para cubrir las aplicaciones de la microscopía. </p><ol><li> Antes de tomar muestras de gotas fluorescentes proteína de los portaobjetos y cubreobjetos deben ser limpiados y recubiert...

<ol>
	<li>Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+in+orange+and+red+fluorescent+proteins.">Photoconversion in orange and red fluorescent proteins.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Methods</em>. <b>6</b>, 355-358 (2009).</li></ol>

<p class="jove_content"> La muestra purificada gota proteína fluorescente es un formato de muestra muy conveniente para la caracterización fotofísicas de proteínas fluorescentes, por ejemplo, para estudiar la cinética y la cinética de photobleaching fotoconversión. El volumen de gota muy pequeña (~ 20 picolitros) facilita photobleaching y experimentos fotoconversión, que puede ser difícil de realizar en los sistemas basados ​​en la cubeta. Además, como se muestra aquí la muestra de gota es ideal para la creación de un microscop...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microsope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR Scientific</td>
<td>48312-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22 mm cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>2940-245</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-octanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>O4500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>methyltrimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MatTek dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corp.</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-019</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells

<p class="jove_content"> Fotoconvertible proteínas fluorescentes (pc-PM) son una clase de proteínas fluorescentes con &quot;resaltador óptico&quot; capacidad, lo que significa que el color de la fluorescencia se puede cambiar por la exposición a la luz de una longitud de onda específica. Destacando óptico no invasivo permite el marcado de una subpoblación de moléculas fluorescentes, lo que es ideal para el seguimiento de las células individuales u orgánulos. </p><p class="jove_content"> Parámetros críticos para fotoconversión eficientes son la intensidad y el tiempo de exposición de la luz fotoconversión. Si la intensidad es demasiado baja, fotoconversión será lento o no ocurrir en absoluto. Por otro lado, demasiada intensidad o la exposición por mucho tiempo puede photobleach la proteína y por lo tanto reducir la eficiencia de fotoconversión. </p><p class="jove_content"> Este protocolo describe un enfoque general de cómo configurar un microscopio láser confocal de barrido para aplicaciones fotoconversión pc-FP. En primer lugar, se describe un procedimiento para la preparación de muestras purificadas gota de proteínas. Este formato de la muestra es muy conveniente para estudiar el comportamiento fotofísicas de proteínas fluorescentes bajo el microscopio. En segundo lugar, vamos a utilizar la muestra de gota de proteínas para mostrar cómo configurar el microscopio en busca de fotoconversión. Y, por último, vamos a mostrar cómo realizar destacando óptica en células vivas, incluidos los de doble óptica con la sonda destacando mOrange2 y Dronpa. </p>

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Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

<p class="jove_content">Este protocolo describe un método general para llevar a cabo fotoconversión de proteínas fluorescentes en un microscopio láser confocal de barrido. Se describen los procedimientos para la fotoconversión de muestras de proteínas puried, así como de doble sonda óptica destacando en células vivas con mOrange2 y Dronpa.</p>

Fotoconversión purificada de proteínas fluorescentes y de doble sonda óptica destacar en células vivas

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Etiquetado de las células madre con tintes fluorescentes para la detección no invasiva con imágenes ópticas

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Investigación

Biología

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Limpieza y cuidado apropiado del microscopio

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

Contraste de fase y de interferencia diferencial microscopía de contraste (DIC)

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Marcaje fluorescente de COS-7 Expresando etiqueta SNAP-proteínas de fusión de imágenes de células vivas

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in <em>Xenopus</em> Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Translocación polarizado de proteínas fluorescentes en<em> Xenopus</em> Ectodermo en respuesta a la señalización de Wnt

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in <em>Drosophila</em> Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Imágenes en directo de las proteínas GFP-etiquetados en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los ovocitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Microscopia intravital para formar imágenes de estructuras subcelulares en ratones vivos que expresan proteínas fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

<em>In vivo</em> Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

<em>En</em> Tracking Clonal <em>vivo</em> de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Reconstitución funcional y la actividad del canal Las mediciones de Purificada Wildtype y mutante CFTR Proteína

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Caracterización de la calcificación Eventos en vivo mediante técnicas ópticas y microscopía electrónica en un Gusano Tubícola Marina

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...