Name: photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells
Uploaded: 2010-06-26T23:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells at JoVE.com

<p class="jove_content"> Vi tackar Mike W. Davidson (Florida State University) att ställa plasmid-DNA-kodning fluorescerande proteiner. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag GM72048 (till DWP). </p>

<p class="jove_title"> 1. Beredning av fluorescerande prover protein droppe </p><p class="jove_content"> En fluorescerande proteinet droppe Urvalet består av ett 1-octanol/water emulsion med fluorescerande proteinet som bor i vattenfasen. Denna emulsion är inklämt mellan ett objektsglas och en 22 mm fyrkant skyddsglas för mikroskopi applikationer. </p><ol><li> Innan fluorescerande proteinet prover droppe på objektglas och glas täcka behöver rengöras och överdragna med ett vattenavvisande medel. </li><li> Rengör glas genom tvättning 5...

<ol>
	<li>Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+in+orange+and+red+fluorescent+proteins.">Photoconversion in orange and red fluorescent proteins.</a> <em style='font-style: italic'>Nature Methods</em>. <b>6</b>, 355-358 (2009).</li></ol>

<p class="jove_content"> Det renade fluorescerande proteinet droppe prov är ett mycket praktiskt prov format för fotofysiska karakterisering av fluorescerande proteiner, till exempel att studera fotoblekning kinetik och kinetik photoconversion. Den extremt liten droppe volym (~ 20 pikoliter) underlättar fotoblekning och experiment photoconversion, vilket kan vara svårt att utföra i kyvett-baserade system. Dessutom, som visas här droppen provet är idealisk för att inrätta ett konfokalmikroskop för photoconversion applikationer. Den hyd...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microsope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR Scientific</td>
<td>48312-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22 mm cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>2940-245</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-octanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>O4500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>methyltrimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MatTek dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corp.</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-019</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells

<p class="jove_content"> Photoconvertible fluorescerande proteiner (PC-FPS) är en klass av fluorescerande proteiner med &quot;optisk överstrykningspenna&quot; funktion, vilket innebär att färgen på fluorescensen kan ändras av exponering för ljus av en viss våglängd. Optisk lyfta möjliggör noninvasiv märkning av en subpopulation av fluorescerande molekyler, och är därför idealisk för att spåra enskilda celler eller organeller. </p><p class="jove_content"> Kritiska parametrar för effektiv photoconversion är intensiteten och exponeringstiden för photoconversion ljus. Om intensiteten är för låg, kommer photoconversion vara långsam eller inte förekomma alls. Å andra sidan kan för mycket intensitet eller för lång exponering photobleach proteinet och därmed minska effektiviteten i photoconversion. </p><p class="jove_content"> Detta protokoll beskriver en allmän riktlinje hur man ställer in en konfokala laserscanning mikroskop för PC-FP photoconversion applikationer. Först beskriver vi en ordning för beredning renat prover protein droppe. Detta prov formatet är mycket bekvämt för att studera fotofysiska beteende fluorescerande proteiner under mikroskop. För det andra kommer vi att använda provet proteinet droppen för att visa hur man konfigurerar mikroskop för photoconversion. Och slutligen, visar vi hur du utför optisk lyfta i levande celler, inklusive dubbla givare optiska markera med mOrange2 och Dronpa. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells at JoVE.com

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

<p class="jove_content">Detta protokoll beskriver en allmän strategi för att utföra photoconversion av fluorescerande proteiner på en konfokala laserskanning mikroskop. Vi beskriver förfaranden för photoconversion av puried protein prover, samt för dual-sond optisk lyfta i levande celler med mOrange2 och Dronpa.</p>

Photoconversion renat fluorescerande proteiner och Dual-probe optisk markering i levande celler

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Märkning stamceller med fluorescerande färger för icke-invasiv Detection med optisk avbildning

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Korrekt vård och rengöring av mikroskopet

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

Faskontrast och differentierad interferenskontrast (DIC) Mikroskopi

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Fluorescerande märkning av COS-7 uttrycka SNAP-tagg fusionsproteiner för levande cell imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in <em>Xenopus</em> Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polariserade flyttning av fluorescerande proteiner i<em> Xenopus</em> Ektoderm som svar på Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in <em>Drosophila</em> Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live avbildning av GFP-märkta proteiner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocyter

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravital Mikroskopi för Imaging subcellulära strukturer i levande möss som uttrycker fluorescerande proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

<em>In vivo</em> Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

<em>In vivo</em> Klon Spårning av hematopoetiska stam och progenitorceller märkta med fem fluorescerande proteiner med hjälp Konfokal och multifoton mikroskopi

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Funktionell beredning och Kanalaktivitets Mätningar av renat Vildtyps och Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Karakterisering av förkalkning händelser Använda Live Optiska och elektronmikroskopi tekniker i en marin Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...