Name: techniques for imaging ca2+ signaling in human sperm
Uploaded: 2010-06-16T17:00:00
Duration: 7 min 38 s
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इस काम वेलकम ट्रस्ट, चिकित्सा अनुसंधान परिषद, रॉयल सोसाइटी, बर्मिंघम साइंस सिटी और बांझपन रिसर्च ट्रस्ट द्वारा वित्त पोषित है. हम निर्माण और एकीकृत इमेजिंग रिसाव में केयर्न अनुसंधान विशेषज्ञ सहायता को स्वीकार करना चाहते हैं.

<ol>
	<li>Haughland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , (2002).</li><li>Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroboscopic+illumination+using+light-emitting+diodes+reduces+phototoxicity+in+fluorescence+cell+imaging.">Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging.</a> Biotechniques. 41, 191-197 (2006).</li></ol>

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

जब सफलतापूर्वक बाहर किया जाता है, इस तकनीक की अनुमति देता है और सहज और प्रेरित 2 Ca मानव शुक्राणु में संकेतों के वितरण कैनेटीक्स की रिकॉर्डिंग. प्रतिक्रियाएँ कक्षों की एक बड़ी संख्या (200 के लिए), जो महत्वपूर्ण है के बाद से मानव शुक्राणु उनके सहज और 2 Ca प्रेरित संकेतों में बदलाव की एक बहुत कुछ दिखा सकते हैं से प्राप्त किया जा सकता है. सफल लेबलिंग और रिकॉर्डिंग के दौरान कोशिकाओं के अस्तित्व नमूना गुणवत्ता पर अत्यधिक निर्भर हैं. गरीब नमूने गरीब लेबलिंग, गरीब प्रतिक्रियाएं और कोशिकाओं रिकॉर्डिंग के दौरान मर सकते हैं दे. मानव शुक्राणु बहुत तस्वीर क्षति के प्रति संवेदनशील हैं और इसलिए हम न्यूनतम आवश्यक रोशनी (दोनों तीव्रता और जोखिम समय) का उपयोग क्रम में सेल अस्तित्व को अधिकतम और कोशिका मृत्यु की वजह से कलाकृतियों को कम से कम. एक कैमरा उच्च संवेदनशीलता कम तीव्रता रोशनी के उपयोग की अनुमति एक महान लाभ है के बाद से कैमरा कमजोर प्रतिदीप्ति ले जाएगा. वापस प्रबुद्ध EM-सीसीडी कैमरों विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल हैं, हालांकि बहुत महंगा है. एलईडी रोशनी (उत्तेजना फिल्टर के साथ एक क्सीनन या पारा दीपक का उपयोग करने के बजाय यह भी सेल अस्तित्व (Nishigaki एट अल, 2006) में सुधार. हम Fura-2 का उपयोग नहीं करते हैं अनुपात - मीट्रिक इमेजिंग के स्पष्ट लाभ के बावजूद, क्योंकि Fura यूवी प्रकाश के साथ उत्तेजना की आवश्यकता है और क्योंकि यह प्रत्येक अनुपात के लिए दो छवियों को ले आवश्यक है. एकल तरंगदैर्ध्य, दृश्य प्रकाश रंजक, बड़े पैमाने पर कोशिकाओं के बीच डाई लोडिंग में अंतर के लिए compensates प्रतिदीप्ति तीव्रता का सामान्यीकरण है, लेकिन एक व्यक्ति सेल के भीतर डाई वितरण के लिए नहीं, और यह मन में वहन किया जाना चाहिए के साथ प्राप्त डेटा के लिए. हालांकि एकल तरंगदैर्ध्य रंजक, सिद्धांत रूप में, कैलिब्रेटेड जा सकता है, तकनीक की सटीकता गरीब है और हम यह करने के लिए प्रयास नहीं करते. जबकि अनुपात Fura - 2 (या उत्सर्जन अनुपात डाई भारत) के साथ प्राप्त अंशांकन के बिना भी, डेटा, में एक रिश्तेदार परिवर्तन के acceptably वफादार प्रतिनिधित्व दे [2 Ca +], मैं एकल तरंगदैर्ध्य रंगों के प्रतिदीप्ति तीव्रता रैखिक से दूर है [ca 2 +] i. से संबंधित एकल तरंगदैर्ध्य रंजक के लिए संतृप्ति वक्र के सबसे उपयोगी हिस्सा ओवर संबंध आमतौर पर लघुगणकीय approximates. हम वर्तमान में उपयोग ओरेगन ग्रीन BAPTA 1 (चित्रा 4) क्योंकि यह में छोटे परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है [2 Ca +] मैं करीब स्तर (5-10 एनएम) आराम करने के लिए. जब [Ca + 2] मैं उगता ऊपर 1 सुक्ष्ममापी प्रतिक्रियाओं के तहत प्रतिदीप्ति परिवर्तन और डाई के मामले में प्रतिनिधित्व हो सकता है तर जाएगा . यूवी उत्तेजना के लिए सहारा के बिना तकनीक के सुधार के लिए एक विकल्प Fluo-3 और Fura लाल के रूप में एक डाई के साथ लोड कोशिकाओं डबल है. दोनों 488 एनएम उत्साहित किया जा सकता है, लेकिन एक साथ अपनी प्रतिक्रिया बहुत अलग हैं. उत्सर्जन के 540 और 650 एनएम पर रिकॉर्डिंग एक अनुपात है जो की सही निगरानी के लिए एक बेहतर तरीका प्रदान कर सकते हैं प्रदान करता है [2 Ca +] (Haughland 2002) मैं और शुक्राणु (Nisigaki एट अल, 2006) लागू किया जा सकता है. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig4.jpg" alt="चित्रा 4" /> चित्रा 4 ओरेगन BAPTA-1 ग्रीन और ओरेगन ग्रीन BAPTA 2 - के लिए मुफ्त [2 Ca +] (एनएम) और शिखर तरंगदैर्ध्य (लगभग 525 एनएम) में प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के बीच संबंध. OGB1 एक उच्च आराम पर प्रतिदीप्ति देता [2 Ca +] लेकिन निचले स्तर पर संतृप्त और इस तरह एक छोटे useable रेंज है. इन भूखंडों के लिए डेटा आण्विक जांच पुस्तिका (Haughland 2002) से प्राप्त किया गया.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Low light level Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QImaging</td>
<td>Rolera XR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oregon Green BAPTA-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>06807</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Andor</td>
<td>IQ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National Institues of Health</td>
<td>Image J</td>
<td>Public domain software</td>
</tr>
<tr>
<td>LED illumination system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cairn Research</td>
<td>Opto LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

techniques for imaging ca2+ signaling in human sperm

फ्लोरोसेंट, CA के साथ लोड कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी<sup&gt; 2 +</sup&gt; - संवेदनशील रंगों Ca के स्थानिक और लौकिक पहलुओं की माप के लिए प्रयोग किया जाता है<sup&gt; 2 +</sup&gt; जीवित कोशिकाओं में संकेत. यहाँ हम Ca के साथ मानव शुक्राणु के निलंबन को लोड करने के लिए हमारी प्रयोगशालाओं में प्रयोग किया जाता विधि का वर्णन<sup&gt; 2 +</supरंजक&gt; रिपोर्टिंग और शारीरिक उत्तेजना के दौरान प्रतिदीप्ति संकेत को मापने. चलता - फिरता कोशिकाओं प्रत्यक्ष तैरना द्वारा अलग कर रहे हैं और 0-24 घंटे के लिए capacitating शर्तों के तहत incubated, प्रयोग पर निर्भर करता है. सेल permeant AM (acetoxy मिथाइल एस्टर) Ca के एस्टर फार्म<sup&gt; 2 +</sup&gt; रिपोर्टिंग डाई तो एक सेल विभाज्य और की अवधि 1 घंटे cytoplasm में डाई की लोडिंग के लिए अनुमति दी जाती है जोड़ा है. हम दृश्य तरंगदैर्ध्य रंगों का उपयोग करें फोटो कोशिकाओं को क्षति को कम है, लेकिन इसका मतलब यह है कि ratiometric रिकॉर्डिंग संभव नहीं है. इस दृष्टिकोण के फायदे और नुकसान पर चर्चा कर रहे हैं. लोड हो रहा है अवधि कोशिकाओं के दौरान एक इमेजिंग चेंबर में पेश कर रहे हैं और के लिए एक पाली - डी lysine लेपित coverslip पालन की अनुमति दी. लोड हो रहा है अवधि अतिरिक्त डाई और ढीली कोशिकाओं के अंत में चैम्बर के छिड़काव तंत्र के लिए कनेक्शन से हटा रहे हैं. चैम्बर लगातार perfused है, उत्तेजनाओं और संशोधित salines तो छिड़काव शीर्ष लेख जोड़ रहे हैं. प्रयोगों से समय चूक प्रतिदीप्ति छवियों के अधिग्रहण द्वारा दर्ज हैं और विस्तार ऑफ़लाइन में मैन्युअल रूप से हित के क्षेत्रों ड्राइंग द्वारा, विश्लेषण. डेटा पूर्व प्रोत्साहन जैसे कि, के लिए प्रत्येक सेल (या किसी कक्ष का भाग), एक ग्राफ Ca दिखा स्तर के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं<sup&gt; 2 +</sup&gt;% प्रतिदीप्ति में परिवर्तन के रूप में प्रतिक्रिया प्राप्त की है.

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Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

उत्तेजना से पैदा [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;] व्यक्तिगत मानव शुक्राणु के संकेतों मैं मूल्यांकन कर रहे हैं. Motile कोशिकाओं Ca के साथ लोड कर रहे हैं<sup&gt; 2 +</sup&gt; संवेदनशील फ्लोरोसेंट (AM-एस्टर विधि) डाई और एक perfusable कक्ष में immobilized. कक्ष समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged हैं और मध्यम के माध्यम से प्रेरित perfusing. एकल कक्षों (या क्षेत्रों) के प्रतिक्रियाएँ Excel का उपयोग कर ऑफ़लाइन विश्लेषण कर रहे हैं.

Ca इमेजिंग तकनीक के लिए 2 + मानव शुक्राणु में संकेतन

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

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में vivo Ca 2 + - हनी बी में घ्राण सीखना दौरान मशरूम शारीरिक न्यूरॉन्स की इमेजिंग

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

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प्रतिदीप्ति बगल में</emमानव शुक्राणु में> संकरण (मछली) प्रोटोकॉल

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

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पैच और आयन चैनल के अध्ययन के लिए दबाना छिड़काव तकनीक में व्यक्त Xenopus Oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

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संवहनी Ca के विज़ुअलाइज़ेशन 2 + संकेतन Paracrine व्युत्पन्न ROS द्वारा ट्रिगर

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

एक उच्च सामग्री इमेजिंग कार्यप्रवाह अभिव्यक्ति क्लोनिंग द्वारा अध्ययन Grb2 परिसर संकेत

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

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सीए के एक साथ माप के लिए मानव आलिंदी myocytes का अलगाव<sup&gt; 2</sup&gt; यात्रियों और झिल्ली धाराओं

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

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Intracellular सीए मापने<sup&gt; 2</supचार तकनीकों का उपयोग करते हुए मानव शुक्राणु में&gt; परिवर्तन: परम्परागत fluorometry, फ्लो fluorometry, फ्लो और सिंगल सेल इमेजिंग रूका

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

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शुक्राणु प्रतिस्पर्धी क्षमता में में आकलन मतभेद<em&gt; ड्रोसोफिला</em

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

इमेजिंग स्थानीय सीए<sup&gt; 2 +</sup&gt; संवर्धित स्तनधारी कोशिकाओं में सिग्नल

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Intracellular सीए की दो photon इमेजिंग<sup&gt; 2 +</sup&gt; एक अलग चूहा महाधमनी के रख रखाव और endothelial में नाइट्रिक ऑक्साइड उत्पादन और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...