Name: Crypt Isolation from Murine Small Intestine (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-02T12:00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Crypt Isolation from Murine Small Intestine at JoVE.com

crypt isolation from murine small intestine

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

Watch this Scientific Journal Video about Crypt Isolation from Murine Small Intestine at JoVE.com

Crypt Isolation from Murine Small Intestine (Video) | JoVE 

Kryptisolering från murin tunntarm

För murin tunntarmskryptisolering, använd ordentligt tvättade fem millimeter med fem millimeter fragment av den isolerade murina tunntarmen. Inkubera bitarna i PBS-antibiotika innehållande två millimolar EDTA i 30 minuter på is utan att skaka. För att underlätta stelningen av den extracellulära matrisen, eller ECM, inkubera en 24-brunnsplatta i en 37 grader Celsius vävnadsodlingsinkubator i förväg.Efter aspirering av EDTA-lösningen från vävnadsfragmenten, tillsätt 25 ml färsk kall PBS-antibiotika. Skaka sedan behållaren kraftigt för hand, 30 till 40 gånger. Filtrera suspensionen en gång genom en sil på 70 mikron.Innan du går vidare till nästa steg, bekräfta närvaron av krypterna under mikroskopet. Centrifugera sedan suspensionen vid 390 G och fyra grader Celsius i tre minuter. Stäng sedan av kryptpelleten igen i 20 ml DMEM innehållande 2% sorbitol, hädanefter kallad sorbitol DMEM.Överför 10 ml av kryptsuspensionen till vart och ett av två nya 15 ml rör. Den här gången centrifugerar du de två rören med en lägre hastighet på 80 G i tre minuter vid fyra grader Celsius för att separera de stora cellmassorna från cellerna eller skräpet. Aspirera supernatanten försiktigt och lämna cirka två milliliter supernatant i varje rör.Tillsätt sedan 10 ml sorbitol DMEM till varje rör. Centrifugera suspensionen igen vid 80 G och fyra grader Celsius i tre minuter. Aspirera supernatanten enligt ovan och tillsätt 10 ml sorbitol DMEM för återsuspension.Efter aspirering av supernatanten, tillsätt 10 ml komplett DMEM och suspendera pelleten igen genom pipettering upp och ner. Låt suspensionen vila i en minut för att få de flytande krypterna effektivt. Efter en minut, filtrera suspensionen från båda rören i ett nytt rör genom en 70 mikron cellsil för att rena krypterna.För att räkna de rena krypterna före sådd, droppa 25 mikroliter droppar i en sex centimeter skål vid tre punkter. Räkna antalet krypter under ett mikroskop vid 4X förstoring och beräkna koncentrationen av krypter per 25 mikroliter. Centrifugera sedan hela filtratet vid 290 G i tre minuter vid fyra grader Celsius.För sådd, suspendera krypterna i ECM i en koncentration av 100 krypter per 40 mikroliter ECM. Pipettera den upp och ner fem till 10 gånger och undvik försiktigt luftbubblor för att få en homogen suspension. Frö sedan 40 mikroliter av kryptsuspensionen per brunn i den förvärmda 24-brunnsplattan.Inkubera 24-brunnsplattan i 15 minuter vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid för polymerisation av ECM. Täck ECM per brunn med 500 mikroliter odlingsmedium innehållande musepidermal tillväxtfaktor, rekombinant mus R-Spondin 1 och rekombinant musnoggin. Den slutliga koncentrationen av material per brunn visas här.Odla kryptorna genom att inkubera vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Utför live-avbildning för att spela in organoidmorfogenes med hjälp av ett Timelapse-bildmikroskop var tredje timme i upp till sju dagar och få seriella Z-staplade bilder. Nästan alla isolerade krypter förseglades omedelbart och verkade konformade när de pressades ut ur epitelnischerna.Vidare var krypterna i slutfraktionen integrerade och lämpliga för användning i kultur. Timelapse-bilder av organoidtillväxt avslöjade att aktiv proliferation och differentiering av tarmstamceller inträffade i kryptregionen med spirande. Budding var kopplad till cellmigration, proliferation och paneth celldifferentiering.

Research

JoVE Journal

Biology

Crypt Isolation from Murine Small Intestine

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

3D-odling av organoider från murina tarmkrypter och en enda stamcell för organoidforskning

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...