Name: Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay
Uploaded: 2023-05-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay at JoVE.com

The video demonstrates how to process images of PA14 plates containing L4 stage worms using Python and ImageJ. It covers measuring plate dimensions, marking coordinates for cropping videos, saving results, and analyzing worm counts for occupancy rates, highlighting the accuracy of counts from images vs. direct observations.

video processing and manual counting for c. elegans lawn avoidance assay

C. elegans Çimden Kaçınma Testi için Akıllı Telefon Tabanlı Görüntüleme

Among the many advantages of studying C. elegans, its simple nervous system offers the opportunity to study how changes at the genetic and cellular level impact network function and behavioral output. Despite having a limited number of neurons, C. elegans display a wide range of complex behaviors. One of these is lawn avoidance, in which the bacterivorous nematode responds to a harmful food source by leaving the bacterial lawn. C. elegans avoid lawns of pathogenic bacteria1,2,3, lawns of bacteria that produce toxins or are spiked with toxins1,4, and even RNAi-expressing bacteria whose target gene knockdown is detrimental to the health of the worms4,5. Studies have shown that worms respond to external cues such as metabolites produced by the pathogenic bacteria1,6, or internal cues that indicate that the food is making them sick4,7. These cues are processed through conserved signaling pathways, such as the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway and the transforming growth factor beta (TGF&#946;) pathway, and require communication between the gut and the nervous system4,6,7,8.
Although the assay is simple, the learned behavior develops over many hours, often overnight. While there are mutants that are incapable of leaving, in which case scoring avoidance at just one time point is sufficient to demonstrate the defect, many mutants do leave eventually but are slower to come out. For these, the movement of the worms needs to be tracked every few hours, which can be difficult to do overnight. Counting itself also takes time, creating a lag time between the plates, and thus limits the number of plates that can be tested at the same time. Using an imaging setup to record many plates simultaneously for the whole duration of the assay would be very useful, but the cost of setup can be prohibitive, depending on the funding situation of the research lab.
To address this, we devised a very simple method that uses smartphones to record avoidance assays. Each phone can record time-lapse videos of up to six assay plates. To provide transmitted light, we use a light emitting diode (LED) light box that can be easily purchased online. Assay plates are placed on an elevated platform, supported by hollow rectangular tunnels, that focus the incoming light, creating contrast. We also provide a Python script that converts the videos into audio video interleave (AVI) files showing 10 s clips of each hourly time point. The videos are then cropped to individual plates and saved in separate files to use for manual counting.
The method provides a low-cost procedure that is also extremely easy to use, using items that are readily available to most people. Here, we describe the method using the well-established lawn avoidance assay against the human pathogen Pseudomonas aeruginosa (PA14), whose protocol has been previously described2,9. Finally, we also review the considerations and limitations of the imaging method for those that want to apply it to other C. elegans behavior experiments.

Yazar Spotlight: C. elegans Çimden Kaçınma Testi için Akıllı Telefon Tabanlı Bir Görüntüleme Yöntemi  

C. elegans Çim Önleme Testi için Akıllı Telefon Tabanlı Bir Görüntüleme Yöntemi

Among the many behaviors displayed by C-elegans, pathogenic lawn avoidance is the worm's defense strategy to minimize its exposure to harmful pathogens. In our lab, we use this behavior as a tool to identify genes involved in the proper functioning of the neurons that mediate this behavior. The lawn avoidance behavior is a simple assay, however it develops over many hours.Hence, it is convenient if the assay can be recorded to observe behavior over long time periods. Also, if multiple assays can be recorded at the same time, that's even better. Although there are many imaging solutions described in the literature, even a few modestly priced cameras may be out of reach for labs with limited resources.Also, some may want to try the assay, but do not plan on doing it long term. For such cases, short-term solutions such as this protocol might help. Our amazing protocol offers an easy, low cost way to record worm behavior.We use smartphones to record the assay, then process the video through a Python script that makes it suitable for counting.

Watch this Scientific Journal Video about Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay at JoVE.com

Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay  

C. elegans Çim Önleme Testi için Video İşleme ve Manuel Sayma

Python betiği extract_frame.py çalıştırarak L4 sahne alanı solucanlarını içeren bir PA14 plakasının boyutlarını tanımlayın. Ardından JPEG dosyasını ImageJ'de açın. Menüden Analiz Et'i seçin, sonra Ölçüleri Ayarla'yı seçin.Ekran etiketi kutusunun işaretli olduğundan emin olun ve pencereyi kapatın. Düz çizgi aracını kullanarak, üzerine bir çizgi çizerek plakanın çapını ölçün. Ardından Analiz Et'i ve ardından menüden Ölçüm'ü seçin.Video 1080 piksel ise, her plaka yaklaşık 480 piksel genişliğinde olacaktır. Bu bilgileri daha sonra kullanmak üzere not defterine girin ve sonuçlar penceresini kapatın. Çok noktalı aracı kullanarak, her plakanın sol üst tarafındaki, kırpılan videoların sol üst köşesi olacak noktaları işaretleyin.Plakaların ne zaman başlatıldığına göre işaretleyin. Tüm plakalar için bir nokta oluşturduktan sonra Analiz Et'i ve ardından menüden Ölçüm'ü seçin. Noktaların X ve Y koordinatlarını içeren ölçümler sonuçlar penceresinde görünecektir.Birden fazla videoyu işlemek için, işlemi ImageJ'de diğer JPEG dosyalarıyla tekrarlayın. Tüm X ve Y koordinatları aynı sonuç penceresinde listelenir. Sonuçlar penceresini bir CSV dosyasına kaydedin.Dosya, film dosyalarıyla aynı dizine kaydedilmelidir. Her plakanın başlangıç saatini bulmak için, filmi bilgisayarda veya telefonda oynatın ve kameranın altına yerleştirilen her plaka setinin başlangıç saatlerini not edin. Sonuçları açın.CSV dosyasına koordinatları içeren bir başlangıç sütunu ekleyin. Tek tek plakalara karşılık gelen her satır için, başlangıç sütununun altına saniye cinsinden uygun başlangıç zamanını girin. Dosyayı kaydedin.Videoları kırpmak ve kırpmak için crop_n_trim çalıştırın. py komut dosyası. Sonuçları seçin.csv dosyası. Plaka boyutlarını ve daha önce belirtilen piksel değerini girin. Komut dosyası artık sonuçların her satırını okuyacaktır.CSV dosyası, komut dosyasının çalışması tamamlandıktan sonra doğru film dosyasını bulmak için kullanılır. Filmle aynı ada sahip bir klasör görünecek ve ardından tahlile karşılık gelen videoların kaydedileceği başlangıç saati görünecektir. El ile sayma için, her AVI dosyasını ImageJ'de açın.Çimlerin dışında görülebilen solucanları sayın ve ardından her zaman noktası için doluluk oranını hesaplayın. Vahşi tip N2 solucanları giderek bakteri çimlerini terk etti ve zamanla doluluk oranında belirtildiği gibi dışarıda kaldı. Doğrudan plakalardan yapılan sayımlar, görüntülenen solucanlardan gelen sayımlarla karşılaştırıldı.Görüntülenen solucanlardan yapılan sayımların son derece doğru olduğu ortaya çıktı. Her bir suş için üç çalışmanın ortalaması alındığında, N2 ve NPR1 suşları sırasıyla% 99.5 ve% 96.2 doğruluk sağlamıştır.

Research

JoVE Journal

Behavior

Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay

A Smartphone-Based Imaging Method for C. elegans Lawn Avoidance Assay

When exposed to toxic or pathogenic bacteria, the nematode Caenorhabditis elegans displays a learned lawn avoidance behavior, in which the worms gradually ...