首先，将143B人骨肉瘤细胞接种在六孔板中。一旦细胞汇合75%，用含有10毫摩尔13C4天冬氨酸的培养基替换每个孔中的培养基，并孵育8小时以达到标记细胞的稳定状态。为了分离代谢物，将制备的缓冲液在零下80摄氏度下冷却过夜或将其放在干冰上。
同时，从培养箱中取出一块板，并使用移液管从每个孔中吸出培养基。用PBS清洗两次，然后去除残留的PBS，然后再继续。现在将板放在干冰上，并向每个孔中加入800微升准备好的缓冲液。
为促进细胞裂解，将板在零下80摄氏度孵育15分钟。孵育后，使用细胞升降机在干冰上刮除每个孔，并将裂解物转移到放置在干冰上的15毫升微量离心管中。将裂解物在4摄氏度下涡旋10分钟，并在4摄氏度和17， 000g下离心10分钟。
然后将上清液转移到1.5毫升微量离心管中，并在4摄氏度的真空浓缩器中用冷阱在高真空下干燥约6小时。将干燥的代谢物沉淀储存在零下80摄氏度，直到进一步使用。为了使用液相色谱质谱或LCMS分析样品，如图所示向干燥的沉淀和涡旋中加入100微升HPLC级水。
以最大速度在 4 摄氏度下离心样品 10 分钟。然后将25微升上清液转移到LCMS小瓶中，并将2微升注入LCMS系统。要进行液相色谱，请使用每分钟0.15毫升的恒定流速，在流动相B的梯度模式下从80%到20%持续20分钟，20至80%持续0.5分钟，并保持在80%下7.5分钟对流动相A。 000道尔顿。
分辨率为70， 000。将 AGC 目标 1 乘以 10 设置为六倍，最大注射时间为 20 毫秒。接下来，将运行时间设置为 16.5 分钟。
极性设置为正。AGC 目标设置为 1 的 5 次方。最大 IT 设置为 20 毫秒。
扫描范围设置为 70 比 1， 000 质荷比。然后将喷雾电压设置为 3.0 千伏。以及275摄氏度的加热毛细管。
选择40个单位的护套气流，15个单位的辅助气流，一个单位的扫掠气流。对于13C5谷氨酰胺同位素示踪，一旦细胞达到75%汇合度，将培养基更换为2毫摩尔含13C5谷氨酰胺的培养基，并孵育以达到标记目标细胞的稳定状态。如前所述分离和分析代谢物。
分离和分析代谢物后，通过计算13C3富马酸盐，13C4富马酸盐，13C3琥珀酸盐和13C4琥珀酸盐的百分比标记来分析琥珀酸脱氢酶或SDH活性。然后使用该公式评估琥珀酸氧化和富马酸盐还原。在载体处理条件下，SDH复合物有利于正向活性，13C4琥珀酸酯掺入13C4富马酸盐高于13C3富马酸盐掺入13C3琥珀酸盐。
在抗霉素治疗的骨肉瘤细胞中，SDH复合物有利于反向活性，并且将13C3富马酸盐掺入13C3琥珀酸盐比13C4琥珀酸盐掺入13C4富马酸盐更显着。
