Para começar, semeie as células de osteossarcoma humano 143B em uma placa de seis poços. Uma vez que as células se tornem 75% confluentes, substitua o meio em cada poço pelo meio contendo 10 milimolares de aspartato 13C4 e incube por oito horas para atingir um estado estacionário para marcar as células. Para isolar metabolitos, arrefecer o tampão preparado durante a noite a menos 80 graus Celsius ou colocá-lo em gelo seco.
Enquanto isso, pegue um prato da incubadora e aspirar o meio de cada poço usando uma pipeta. Lave-o com PBS duas vezes e, em seguida, remova o PBS residual antes de prosseguir. Agora coloque a placa em gelo seco e adicione 800 microlitros de tampão preparado a cada poço.
Para facilitar a lise celular, incube a placa por 15 minutos a 80 graus Celsius negativos. Após a incubação, raspe cada poço em gelo seco usando um elevador de células e transfira o lisado para um tubo de microcentrífuga de 15 mililitros colocado em gelo seco. Vórtice o lisado por 10 minutos a quatro graus Celsius e centrifujo-o a quatro graus Celsius e 17.000 g por 10 minutos.
Em seguida, transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e seque-o em um concentrador de vácuo de quatro graus Celsius com uma armadilha fria sob alto vácuo por aproximadamente seis horas. Conservar o pellet de metabolito seco a menos 80 graus Celsius até uma nova utilização. Para analisar a amostra usando cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas ou LCMS, adicione 100 microlitros de água grau HPLC ao pellet seco e ao vórtice, conforme demonstrado.
Centrifugar as amostras a quatro graus Celsius durante 10 minutos à velocidade máxima. Em seguida, transfira 25 microlitros de sobrenadante para o frasco LCMS e injete dois microlitros no sistema LCMS. Para realizar a cromatografia líquida, use uma taxa de fluxo constante de 0,15 mililitro por minuto, sob o modo gradiente de uma fase móvel B de 80 a 20% por 20 minutos, 20 a 80% por 0,5 minutos e mantenha a 80% por 7,5 minutos contra a fase móvel A.Em seguida, execute espectroscopia de massa escolhendo uma varredura completa entre mz 70 a 1, 000 Dalton.
E resolução em 70.000. Defina a meta AGC de uma vez 10 para o sexto e um tempo máximo de injeção de 20 milissegundos. Em seguida, defina o tempo de execução para 16,5 minutos.
Polaridade definida como positiva. A meta da AGC foi definida para um até a potência de cinco. Máximo de TI definido como 20 milissegundos.
E faixa de varredura definida para 70 a 1.000 relação massa/carga. Em seguida, ajuste a tensão de pulverização em 3,0 quilovolts. E o capilar aquecido a 275 graus Celsius.
Selecione o fluxo de gás da bainha em 40 unidades, o fluxo de gás auxiliar em 15 unidades e o fluxo de gás de varredura em uma unidade. Para o traçado isotópico da glutamina 13C5, uma vez que as células atinjam 75% de confluência, mude o meio para meio contendo glutamina 13C5 milimolar e incube para atingir um estado estável de marcação das células de interesse. Isolar e analisar os metabólitos conforme demonstrado anteriormente.
Após isolar e analisar os metabólitos, analise a atividade da succinato desidrogenase ou SDH calculando a porcentagem de marcação de fumarato 13C3, fumarato 13C4, succinato 13C3 e succinato 13C4. Em seguida, avalie a oxidação do succinato e a redução do fumarato usando a fórmula. Em condições tratadas com veículo, o complexo SDH favoreceu a atividade anterior, e a incorporação do succinato 13C4 no fumarato 13C4 foi maior do que o fumarato 13C3 no succinato 13C3.
Em células de osteossarcoma tratadas com antimicina, o complexo SDH favoreceu a atividade reversa, e a incorporação de fumarato de 13C3 no succinato de 13C3 foi mais significativa do que o succinato de 13C4 no fumarato de 13C4.
