Name: High-Pressure Freezing (HPF), Freeze-Substitution Fixation (FSF) and Rehydration of Sapphire Disc-Carrier Assembly
Uploaded: 2023-04-28T12:20:00
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The video details a step-by-step protocol for high-pressure freezing and freeze-substitution fixation of biological samples. It includes preparation of aluminum carriers, use of sapphire disks, and controlled temperature incubations with various solutions to preserve cellular structures for further analysis.

high-pressure freezing (hpf), freeze-substitution fixation (fsf) and rehydration of sapphire disc-carrier assembly

Synthèse directe de nanoparticules d’or pour l’analyse de localisation des protéines

In the postgenomic era, the development of green fluorescent protein (GFP) as a single-molecule reporter for light microscopy has revolutionized the field of modern life science research1,2. For decades, electron microscopy (EM) has been a powerful tool for intuitively observing the cellular ultrastructure with nanoscale resolution3; however, the precise identification and localization of protein molecules remain challenging.
The most commonly used EM labeling technique is the immunoelectron microscopy (IEM) labeling technique, which is based on the antigen-antibody reaction. However, although many techniques have been developed in the field of IEM labeling, including pre-embedding IEM and post-embedding IEM (on resin sections or hydrated cryosections), it still suffers from low labeling efficiency (&#60;10%)4,5, which is related to the sample preparation and antibody quality. To overcome these limitations, developing genetically encoded tags has great application potential.
Two main types of EM tags have been thoroughly explored in recent years. One type is the DAB staining method, which utilizes tags such as APEX2 to oxidize 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) to osmiophilic polymers for EM visualization6,7,8,9,10,11,12. It enables the labeling of high-abundance proteins in subcellular regions but is not suitable for single-molecule counting. The other type utilizes metal-binding proteins, such as ferritin13 and metallothionein (MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, to generate electron-dense metal deposits in situ for EM visualization. Only the latter has real potential for single-molecule visualization and counting. The molecular size of ferritin is too large (~450 kD) for it to be used as a promising tag, whereas the small size (~5 kD) of MT and its ability to bind various ions through its 20 cysteines have attracted great attention. Several labs have tried to label purified MT-fusion proteins or MT-expressing cells by incubating directly with Au+. These attempts have initially proved that MT tags can bind gold ions to form high-contrast signals, but none have really achieved the effective identification of individual proteins in cells, and they are not widely applicable14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
The ANSM-based AuNP synthesis technique, which involves synthesizing 2-6 nm-sized AuNPs directly on cysteine-rich tags (e.g., MT, the MT variants MTn and MT&#945;, AFP) as electron-dense labels for EM visualization, is the first reliable and applicable approach for protein labeling and single molecule detection in cells24,25,26. It allows for the specific synthesis of AuNPs on isolated tag fusion proteins and has achieved an unprecedented labeling efficiency in nonfixed or chemically fixed prokaryotic (E. coli) and eukaryotic (S. pombe) cells. However, implementing the same protocol in more advanced systems such as mammalian cells or even tissues involves additional challenges, such as the more complex intracellular redox homeostasis and more fragile cellular structure.
This study presents a clonable EM labeling technology, which combines the novel ANSM-based AuNP synthesis technique for labeling genetically encoded cysteine-rich tags (MT) with the HPF/FSF-rehydration-HPF/FSF sample preparation method, enables the unambiguous single-molecule identification of tagged proteins in the ER membrane, ER lumen, and mitochondrial matrix in HeLa cells. The current method combines the characteristics of high labeling efficiency, a high signal-to-noise ratio, single-molecule labeling, and strong universality, and this method has broad application prospects in life science research.

Pleins feux sur l’auteur : Synthèse directe de nanoparticules d’or visibles EM dans les cellules pour l’analyse de la localisation des protéines avec une ultrastructure bien préservée  

Synthèse directe de nanoparticules d’or EM-visibles dans des cellules pour l’analyse de localisation des protéines avec une ultrastructure bien préservée

Protein detection and localization are essential in biological research. Our protocol describes a novel EM-labeling technology using genetically-encoded tags which allows single-molecule visualization in situ with well-preserved ultrastructure. It is crucial to avoid over-fixation.The labeling method is based on the activity of cysteines in the tags, which are highly sensitive to aldehyde cross-linking. Our protocol avoids use of aldehyde fixatives and preserves the tag activity and ultrastructure. at the same time.EM labeling has always been challenging, suffering from poor morphology or inefficient labeling. Our protocols synthesizes in situ nanoparticles directly on individual proteins to provide clear and precise localization of the target proteins, with a high signal-to-noise ratio, high efficiency, and specificity. We have so far achieved excellent labeling in isolated proteins, E.coli cells, yeast cells, and HeLa cells.We will explore and optimize the method for application to tissue samples. Combining the prevailing cryo-FIB and cryo-EM technologies will allow us to address important biological questions.

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High-Pressure Freezing (HPF), Freeze-Substitution Fixation (FSF) and Rehydration of Sapphire Disc-Carrier Assembly  

Congélation à haute pression (HPF), fixation par substitution de gel (FSF) et réhydratation de l’ensemble disque-support en saphir

Préparez une machine de congélation à haute pression ou HPF, au moins deux heures avant de commencer l’expérience selon les instructions du fabricant. Transférer les supports en aluminium HPF de type A dans un tube centrifuge de deux millimètres contenant un millilitre d’éthanol et les sonifier dans un nettoyeur à ultrasons pendant 10 minutes. Sécher les supports dans une boîte de Petri recouverte de papier filtre qualitatif.Faire tremper les supports pré-nettoyés dans du 1-hexadécène. Utilisez une pince à épiler fine pour ramasser un disque de saphir pré-préparé dans le plat de culture cellulaire HeLa. Touchez la surface étiquetée avec du papier filtre qualitatif pour éliminer l’excès de milieu.Montez le disque de saphir dans le porte-échantillon HPF et coiffez rapidement le disque avec un support en aluminium de 0,025 millimètre de profondeur contenant du 1-hexadécène. Aspirer l’excès de solution avec du papier filtre qualitatif. Chargez le porte-échantillon pour la congélation à haute pression.Déchargez le support de disque saphir sous azote liquide dans une boîte cryogénique en mousse. Préparez deux millilitres de la fixation de substitution de la congélation ou de la solution FSF un dans un récipient rond en polypropylène de 20 millimètres dans une hotte et congelez-le à l’azote liquide. Utilisez une paire de pincettes pré-refroidies pour charger les disques de saphir et les assemblages de support dans le récipient avec la solution FSF congelée un sous azote liquide.Transférez ce récipient dans une chambre de congélation automatisée pré-refroidie pour le traitement FSF à moins 90 degrés Celsius. Conservez les échantillons à moins 90 degrés Celsius pendant une heure, puis séparez les disques de saphir des supports avec une pince à épiler pré-refroidie, en vous assurant que les côtés marqués des disques de saphir sont orientés vers le bas. Conservez les spécimens à moins 90 degrés Celsius pendant 8 à 10 heures supplémentaires avant de les réchauffer à moins 60 degrés Celsius dans les trois heures.Remplacez la solution FSF un dans le récipient par de l’acétone prérefroidie et incuber à moins 60 degrés Celsius pendant une heure. Répétez ce lavage à l’acétone deux fois. Réchauffez-vous à moins 30 degrés Celsius en trois heures.Pendant ce temps, préparez et pré-refroidissez deux millilitres de la solution FSF deux dans un tube centrifuge de deux millilitres à moins 30 degrés Celsius. Remplacer l’acétone par la solution FSF deux et incuber à moins 30 degrés Celsius pendant trois heures. Ensuite, remplacez la solution FSF deux dans le récipient avec de l’acétone pré-refroidie et incuber pendant 30 minutes à moins 30 degrés Celsius.Répétez ce lavage à l’acétone deux fois. Chaud pour moins 30 à 4 degrés Celsius dans les deux heures. Remplacez l’acétone par deux millilitres de tampon HEPES 0,2 molaire.Changez le tampon une fois et incuber à température ambiante ou à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

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