Name: High-Pressure Freezing (HPF), Freeze-Substitution Fixation (FSF) and Rehydration of Sapphire Disc-Carrier Assembly
Uploaded: 2023-04-28T12:20:00
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The video details a step-by-step protocol for high-pressure freezing and freeze-substitution fixation of biological samples. It includes preparation of aluminum carriers, use of sapphire disks, and controlled temperature incubations with various solutions to preserve cellular structures for further analysis.

high-pressure freezing (hpf), freeze-substitution fixation (fsf) and rehydration of sapphire disc-carrier assembly

Direkte Synthese von Goldnanopartikeln für die Proteinlokalisierungsanalyse

In the postgenomic era, the development of green fluorescent protein (GFP) as a single-molecule reporter for light microscopy has revolutionized the field of modern life science research1,2. For decades, electron microscopy (EM) has been a powerful tool for intuitively observing the cellular ultrastructure with nanoscale resolution3; however, the precise identification and localization of protein molecules remain challenging.
The most commonly used EM labeling technique is the immunoelectron microscopy (IEM) labeling technique, which is based on the antigen-antibody reaction. However, although many techniques have been developed in the field of IEM labeling, including pre-embedding IEM and post-embedding IEM (on resin sections or hydrated cryosections), it still suffers from low labeling efficiency (&#60;10%)4,5, which is related to the sample preparation and antibody quality. To overcome these limitations, developing genetically encoded tags has great application potential.
Two main types of EM tags have been thoroughly explored in recent years. One type is the DAB staining method, which utilizes tags such as APEX2 to oxidize 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) to osmiophilic polymers for EM visualization6,7,8,9,10,11,12. It enables the labeling of high-abundance proteins in subcellular regions but is not suitable for single-molecule counting. The other type utilizes metal-binding proteins, such as ferritin13 and metallothionein (MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, to generate electron-dense metal deposits in situ for EM visualization. Only the latter has real potential for single-molecule visualization and counting. The molecular size of ferritin is too large (~450 kD) for it to be used as a promising tag, whereas the small size (~5 kD) of MT and its ability to bind various ions through its 20 cysteines have attracted great attention. Several labs have tried to label purified MT-fusion proteins or MT-expressing cells by incubating directly with Au+. These attempts have initially proved that MT tags can bind gold ions to form high-contrast signals, but none have really achieved the effective identification of individual proteins in cells, and they are not widely applicable14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
The ANSM-based AuNP synthesis technique, which involves synthesizing 2-6 nm-sized AuNPs directly on cysteine-rich tags (e.g., MT, the MT variants MTn and MT&#945;, AFP) as electron-dense labels for EM visualization, is the first reliable and applicable approach for protein labeling and single molecule detection in cells24,25,26. It allows for the specific synthesis of AuNPs on isolated tag fusion proteins and has achieved an unprecedented labeling efficiency in nonfixed or chemically fixed prokaryotic (E. coli) and eukaryotic (S. pombe) cells. However, implementing the same protocol in more advanced systems such as mammalian cells or even tissues involves additional challenges, such as the more complex intracellular redox homeostasis and more fragile cellular structure.
This study presents a clonable EM labeling technology, which combines the novel ANSM-based AuNP synthesis technique for labeling genetically encoded cysteine-rich tags (MT) with the HPF/FSF-rehydration-HPF/FSF sample preparation method, enables the unambiguous single-molecule identification of tagged proteins in the ER membrane, ER lumen, and mitochondrial matrix in HeLa cells. The current method combines the characteristics of high labeling efficiency, a high signal-to-noise ratio, single-molecule labeling, and strong universality, and this method has broad application prospects in life science research.

Autor im Rampenlicht: Direkte Synthese von EM-sichtbaren Goldnanopartikeln in Zellen für die Proteinlokalisierungsanalyse mit gut erhaltener Ultrastruktur  

Direkte Synthese von EM-sichtbaren Gold-Nanopartikeln in Zellen zur Proteinlokalisierungsanalyse mit gut erhaltener Ultrastruktur

Protein detection and localization are essential in biological research. Our protocol describes a novel EM-labeling technology using genetically-encoded tags which allows single-molecule visualization in situ with well-preserved ultrastructure. It is crucial to avoid over-fixation.The labeling method is based on the activity of cysteines in the tags, which are highly sensitive to aldehyde cross-linking. Our protocol avoids use of aldehyde fixatives and preserves the tag activity and ultrastructure. at the same time.EM labeling has always been challenging, suffering from poor morphology or inefficient labeling. Our protocols synthesizes in situ nanoparticles directly on individual proteins to provide clear and precise localization of the target proteins, with a high signal-to-noise ratio, high efficiency, and specificity. We have so far achieved excellent labeling in isolated proteins, E.coli cells, yeast cells, and HeLa cells.We will explore and optimize the method for application to tissue samples. Combining the prevailing cryo-FIB and cryo-EM technologies will allow us to address important biological questions.

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High-Pressure Freezing (HPF), Freeze-Substitution Fixation (FSF) and Rehydration of Sapphire Disc-Carrier Assembly  

Hochdruckgefrieren (HPF), Gefriersubstitutionsfixierung (FSF) und Rehydrierung der Saphir-Disc-Carrier-Baugruppe

Bereiten Sie mindestens zwei Stunden vor Beginn des Experiments gemäß den Anweisungen des Herstellers eine Hochdruckgefrier- oder HPF-Maschine vor. Übertragen Sie HPF-Aluminiumträger vom Typ A in ein Zwei-Millimeter-Zentrifugenröhrchen mit einem Milliliter Ethanol und beschallen Sie sie 10 Minuten lang in einem Ultraschallreiniger. Trocknen Sie die Träger in einer Petrischale, die mit hochwertigem Filterpapier bedeckt ist.Tränken Sie die vorgereinigten Träger in 1-Hexadecen. Nehmen Sie mit einer feinen Pinzette eine vorbereitete Saphirscheibe aus der HeLa-Zellkulturschale. Berühren Sie die beschriftete Oberfläche mit hochwertigem Filterpapier, um das überschüssige Medium zu entfernen.Montieren Sie die Saphirscheibe in den HPF-Probenhalter und verschließen Sie die Scheibe schnell mit einem 0,025 Millimeter tiefen Aluminiumträger, der 1-Hexadecen enthält. Überschüssige Lösung mit qualitativem Filterpapier absaugen. Beladen Sie den Probenhalter für das Hochdruckgefrieren.Entladen Sie die Saphirscheibenträgerbaugruppe unter flüssigem Stickstoff in einer Schaumstoff-Kryobox. Bereiten Sie zwei Milliliter der Gefriersubstitutionsfixierung oder FSF-Lösung in einem runden 20-Millimeter-Polypropylenbehälter in einem Abzug vor und frieren Sie ihn mit flüssigem Stickstoff ein. Verwenden Sie eine vorgekühlte Pinzette, um die Saphirscheiben und Trägerbaugruppen in den Behälter mit gefrorener FSF-Lösung unter flüssigem Stickstoff zu laden.Übergeben Sie diesen Behälter in eine vorgekühlte automatisierte Gefriersubstitutionsmaschinenkammer für die FSF-Verarbeitung bei minus 90 Grad Celsius. Halten Sie die Proben eine Stunde lang bei minus 90 Grad Celsius, trennen Sie dann die Saphirscheiben mit einer vorgekühlten Pinzette von den Trägern und achten Sie darauf, dass die markierten Seiten der Saphirscheiben nach unten zeigen. Halten Sie die Proben weitere 8 bis 10 Stunden bei minus 90 Grad Celsius, bevor Sie sich innerhalb von drei Stunden auf minus 60 Grad Celsius erwärmen.Ersetzen Sie die FSF-Lösung im Behälter durch vorgekühltes Aceton und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei minus 60 Grad Celsius. Wiederholen Sie diese Acetonwäsche zweimal. Innerhalb von drei Stunden auf minus 30 Grad Celsius erwärmen.Währenddessen zwei Milliliter FSF-Lösung zwei in einem Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchen bei minus 30 Grad Celsius vorbereiten und vorkühlen. Ersetzen Sie das Aceton durch FSF-Lösung zwei und inkubieren Sie es drei Stunden lang bei minus 30 Grad Celsius. Ersetzen Sie dann die FSF-Lösung zwei im Behälter durch vorgekühltes Aceton und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei minus 30 Grad Celsius.Wiederholen Sie diese Acetonwäsche zweimal. Innerhalb von zwei Stunden auf minus 30 bis 4 Grad Celsius erwärmen. Ersetzen Sie das Aceton durch zwei Milliliter 0,2 molaren HEPES-Puffer.Wechseln Sie den Puffer einmal und inkubieren Sie ihn bei Raumtemperatur oder vier Grad Celsius über Nacht.