Name: High-Pressure Freezing (HPF), Freeze-Substitution Fixation (FSF) and Rehydration of Sapphire Disc-Carrier Assembly
Uploaded: 2023-04-28T12:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Pressure Freezing HPF, Freeze-Substitution Fixation FSF and Rehydration of Sapphire Disc-Carrier Assembly at JoVE.com

The video details a step-by-step protocol for high-pressure freezing and freeze-substitution fixation of biological samples. It includes preparation of aluminum carriers, use of sapphire disks, and controlled temperature incubations with various solutions to preserve cellular structures for further analysis.

high-pressure freezing (hpf), freeze-substitution fixation (fsf) and rehydration of sapphire disc-carrier assembly

Protein Lokalizasyon Analizi için Altın Nanopartiküllerin Doğrudan Sentezi

In the postgenomic era, the development of green fluorescent protein (GFP) as a single-molecule reporter for light microscopy has revolutionized the field of modern life science research1,2. For decades, electron microscopy (EM) has been a powerful tool for intuitively observing the cellular ultrastructure with nanoscale resolution3; however, the precise identification and localization of protein molecules remain challenging.
The most commonly used EM labeling technique is the immunoelectron microscopy (IEM) labeling technique, which is based on the antigen-antibody reaction. However, although many techniques have been developed in the field of IEM labeling, including pre-embedding IEM and post-embedding IEM (on resin sections or hydrated cryosections), it still suffers from low labeling efficiency (&#60;10%)4,5, which is related to the sample preparation and antibody quality. To overcome these limitations, developing genetically encoded tags has great application potential.
Two main types of EM tags have been thoroughly explored in recent years. One type is the DAB staining method, which utilizes tags such as APEX2 to oxidize 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) to osmiophilic polymers for EM visualization6,7,8,9,10,11,12. It enables the labeling of high-abundance proteins in subcellular regions but is not suitable for single-molecule counting. The other type utilizes metal-binding proteins, such as ferritin13 and metallothionein (MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, to generate electron-dense metal deposits in situ for EM visualization. Only the latter has real potential for single-molecule visualization and counting. The molecular size of ferritin is too large (~450 kD) for it to be used as a promising tag, whereas the small size (~5 kD) of MT and its ability to bind various ions through its 20 cysteines have attracted great attention. Several labs have tried to label purified MT-fusion proteins or MT-expressing cells by incubating directly with Au+. These attempts have initially proved that MT tags can bind gold ions to form high-contrast signals, but none have really achieved the effective identification of individual proteins in cells, and they are not widely applicable14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
The ANSM-based AuNP synthesis technique, which involves synthesizing 2-6 nm-sized AuNPs directly on cysteine-rich tags (e.g., MT, the MT variants MTn and MT&#945;, AFP) as electron-dense labels for EM visualization, is the first reliable and applicable approach for protein labeling and single molecule detection in cells24,25,26. It allows for the specific synthesis of AuNPs on isolated tag fusion proteins and has achieved an unprecedented labeling efficiency in nonfixed or chemically fixed prokaryotic (E. coli) and eukaryotic (S. pombe) cells. However, implementing the same protocol in more advanced systems such as mammalian cells or even tissues involves additional challenges, such as the more complex intracellular redox homeostasis and more fragile cellular structure.
This study presents a clonable EM labeling technology, which combines the novel ANSM-based AuNP synthesis technique for labeling genetically encoded cysteine-rich tags (MT) with the HPF/FSF-rehydration-HPF/FSF sample preparation method, enables the unambiguous single-molecule identification of tagged proteins in the ER membrane, ER lumen, and mitochondrial matrix in HeLa cells. The current method combines the characteristics of high labeling efficiency, a high signal-to-noise ratio, single-molecule labeling, and strong universality, and this method has broad application prospects in life science research.

Yazar Spotlight: İyi Korunmuş Ultrastructure ile Protein Lokalizasyon Analizi için Hücrelerde EM-Görünür Altın Nanopartiküllerin Doğrudan Sentezi  

İyi Korunmuş Ultrayapı ile Protein Lokalizasyon Analizi için Hücrelerde EM-Görünür Altın Nanopartiküllerinin Doğrudan Sentezi

Protein detection and localization are essential in biological research. Our protocol describes a novel EM-labeling technology using genetically-encoded tags which allows single-molecule visualization in situ with well-preserved ultrastructure. It is crucial to avoid over-fixation.The labeling method is based on the activity of cysteines in the tags, which are highly sensitive to aldehyde cross-linking. Our protocol avoids use of aldehyde fixatives and preserves the tag activity and ultrastructure. at the same time.EM labeling has always been challenging, suffering from poor morphology or inefficient labeling. Our protocols synthesizes in situ nanoparticles directly on individual proteins to provide clear and precise localization of the target proteins, with a high signal-to-noise ratio, high efficiency, and specificity. We have so far achieved excellent labeling in isolated proteins, E.coli cells, yeast cells, and HeLa cells.We will explore and optimize the method for application to tissue samples. Combining the prevailing cryo-FIB and cryo-EM technologies will allow us to address important biological questions.

Watch this Scientific Journal Video about High-Pressure Freezing HPF, Freeze-Substitution Fixation FSF and Rehydration of Sapphire Disc-Carrier Assembly at JoVE.com

High-Pressure Freezing (HPF), Freeze-Substitution Fixation (FSF) and Rehydration of Sapphire Disc-Carrier Assembly  

Yüksek basınçlı dondurma (HPF), dondurarak ikame fiksasyonu (FSF) ve safir disk taşıyıcı tertibatının rehidrasyonu

Üreticinin talimatlarına göre deneye başlamadan en az iki saat önce yüksek basınçlı bir dondurma veya HPF makinesi hazırlayın. Tip A HPF alüminyum taşıyıcıları bir mililitre etanol içeren iki milimetrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve bunları 10 dakika boyunca ultrasonik bir temizleyicide sonikleştirin. Taşıyıcıları kalitatif filtre kağıdı ile kaplı bir Petri kabında kurutun.Önceden temizlenmiş taşıyıcıları 1-hekzadesen içine batırın. HeLa hücre kültürü kabından önceden hazırlanmış safir diski almak için ince cımbız kullanın. Fazla ortamı çıkarmak için etiketli yüzeye kalitatif filtre kağıdı ile dokunun.Safir diski HPF numune tutucusuna monte edin ve diski 1-hekzadesen içeren 0,025 milimetre derinliğinde alüminyum taşıyıcı ile hızlı bir şekilde kapatın. Kalitatif filtre kağıdı ile fazla çözeltiyi aspire edin. Yüksek basınçlı dondurma için numune tutucuyu yükleyin.Safir disk taşıyıcı tertibatını sıvı azot altında bir köpük kriyo kutusunda boşaltın. İki mililitre dondurarak ikame fiksasyonu veya FSF çözeltisi hazırlayın, biri duman davlumbazında 20 milimetrelik yuvarlak bir polipropilen kapta ve sıvı azot kullanarak dondurun. Safir diskleri ve taşıyıcı tertibatları, biri sıvı azot altında dondurulmuş FSF çözeltisi ile kaba yüklemek için bir çift önceden soğutulmuş cımbız kullanın.Bu kabı, eksi 90 santigrat derecede FSF işlemesi için önceden soğutulmuş otomatik dondurarak ikame makinesi odasına aktarın. Örnekleri bir saat boyunca eksi 90 santigrat derecede tutun, ardından safir diskleri önceden soğutulmuş cımbızla taşıyıcılardan ayırın ve safir disklerin işaretli taraflarının aşağı baktığından emin olun. Üç saat içinde eksi 60 santigrat dereceye kadar ısınmadan önce örnekleri eksi 90 santigrat derecede 8 ila 10 saat daha tutun.FSF çözeltisini kapta önceden soğutulmuş asetonla değiştirin ve bir saat boyunca eksi 60 santigrat derecede inkübe edin. Bu aseton yıkamayı iki kez tekrarlayın. Üç saat içinde eksi 30 santigrat dereceye kadar ısıtın.Bu arada, eksi 30 santigrat derecede iki mililitrelik bir santrifüj tüpünde iki mililitre FSF çözeltisi hazırlayın ve önceden soğutun. Asetonu FSF çözeltisi iki ile değiştirin ve üç saat boyunca eksi 30 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra kaptaki FSF çözeltisini iki önceden soğutulmuş asetonla değiştirin ve eksi 30 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin.Bu aseton yıkamayı iki kez tekrarlayın. İki saat içinde eksi 30 ila 4 santigrat derece ısıtın. Asetonu, iki mililitre 0.2 molar HEPES tamponu ile değiştirin.Tamponu bir kez değiştirin ve oda sıcaklığında veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.