Возьмите предварительно подготовленный сапфировый диск, обработанный HPF и FSF, содержащий стабильные клетки HeLa, промойте его буфером PBS-A в течение пяти минут и повторите этот процесс три раза. Перенесите сапфировые диски в 35-миллиметровую культуральную чашку, содержащую один миллилитр буфера PBS-A при комнатной температуре. Замените буфер PBS-A в чашке для культур одним миллилитром восстановительного раствора и выдерживайте в течение часа при комнатной температуре.
Приготовьте прекурсор золота в одном миллилитре восстановительного раствора и сразу же перемешайте вихревым способом. Добавьте 80 микролитров 500-миллимолярного D-пеницилламина в двойной дистиллированной воде в раствор предшественника золота. И сразу вихрь.
Замените раствор в культивируемой посуде одним миллилитром раствора предшественника золота и выдерживайте в течение двух часов при четырех градусах Цельсия. Добавьте от 20 до 100 микролитров свежеприготовленного раствора борогидрида натрия в раствор предшественника золота, немедленно встряхните, чтобы хорошо перемешать, и выдерживайте в течение пяти минут при комнатной температуре. Замените раствор двумя миллилитрами буфера PBS-A, чтобы остановить реакцию.
Затем приготовьте смесь эпоксидной смолы в соответствии с инструкциями производителя, перенесите сапфировые диски на капсулы для встраивания с плоским дном и пропитайте смолой не менее 30 минут при комнатной температуре. Полимеризуйте образец при температуре 60 градусов Цельсия в духовке не менее 18 часов. Подготовьте ультратонкие срезы полимеризованного образца, осторожно обрезав блоки образца бритвой, чтобы обнажить сапфировые диски.
Опустите наконечники блоков с сапфировыми дисками в жидкий азот на несколько секунд и разморозьте при комнатной температуре. Повторите действие замораживания-оттаивания несколько раз, чтобы отсоединить диски от блоков. Белок EGFP-MTn-KDEL появился в виде наночастиц золота размером от двух до пяти нанометров, распределенных исключительно в периферическом просвете ER и в перинуклеарном пространстве ядерной оболочки.
Хорошо сохранившаяся ультраструктура позволила идентифицировать меченые белки по одной молекуле и облегчила анализ взаимодействий органелл, таких как взаимодействия митохондрий ER. Наночастицы белка Ost4-EGFP-MTn очерчивали мембрану ER во внешней мембране ядерной оболочки. Аналогичным образом, клетки, экспрессирующие Mito-acGFP-MTn, проявляли специфическую маркировку в митохондриальном матриксе.
