Name: Sample Preparation and Confocal Imaging of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana
Uploaded: 2023-05-12T14:00:00
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This video demonstrates a detailed protocol for imaging membrane trafficking in transgenic Arabidopsis thaliana leaves using fluorescent proteins. It includes steps for sample preparation, setting up laser excitation, and capturing images and time series data to analyze the localization of ERL1 and MVBs in stomatal lineage cells.

sample preparation and confocal imaging of dual-colored f1 transgenic arabidopsis thaliana

컨포칼 이미징을 통한 ERL1 동역학의 시공간 조사

Membrane traffic is a conserved cellular process that distributes membrane components (also known as cargoes), including proteins, lipids, and other biological products, between different organelles within a eukaryotic cell or across the plasma membrane to and from the extracellular space1. This process is facilitated by a collection of membranes and organelles named the endomembrane system, which consists of the nuclear membrane, the endoplasmic reticulum, the Golgi apparatus, the vacuole/lysosomes, the plasma membrane, and multiple endosomes1. The endomembrane system enables the modification, packaging, and transport of membrane components using dynamic vesicles that shuttle between these organelles. Membrane trafficking events are crucial to cell development, growth, and environmental adaptation and, thus, are under stringent and complex regulation2. Currently, multiple approaches in molecular biology, chemical biology, microscopy, and mass spectrometry have been developed and applied to the field of membrane trafficking and have greatly advanced the understanding of the spatiotemporal regulation of the endomembrane system3,4. Molecular biology is used for classical genetic manipulations of the putative players involved in membrane trafficking, such as altering the gene expression of the protein of interest or labeling the protein of interest with certain tags. Tools in chemical biology include the usage of molecules that specifically interfere with the traffic of certain routes4,5. Mass spectrometry is powerful for identifying the components in an organelle that has been mechanically isolated by biochemical approaches3,4. However, membrane traffic is a dynamic, diverse, and complex biological process1. To visualize the membrane trafficking process in live cells under various conditions, light microscopy is an essential tool. Continuous progress has been made in advanced microscope techniques to overcome the challenges in measuring the efficiency, kinetics, and diversity of the events4. Here, this study focuses on the widely adopted methodologies in chemical/pharmacological biology, molecular biology, and microscopy to study membrane trafficking events in a naturally simplified and experimentally accessible system, the stomatal developmental process.
Stomata are micropores on plant aerial surfaces that open and close to facilitate gas exchange between the inner cells and the environment6,7,8. Hence, stomata are essential for photosynthesis and transpiration, two events that are crucial for plant survival and growth. Stomatal development is dynamically adjusted by environmental cues to optimize the plant&#39;s adaptation to the surroundings9. Dating back to studies in 2002, the identification of the receptor protein Too Many Mouths (TMM) opened the door to a new era of investigating the molecular mechanisms of stomatal development in the model plant Arabidopsis thaliana10. After just a few decades, a classical signaling pathway has been identified. From upstream to downstream, this pathway includes a group of secretory peptide ligands in the epidermal patterning factors (EFP) family, several cell-surface leucine-rich-repeat (LRR) receptor kinases in the EREECTA (ER) family, the LRR receptor protein TMM, a MAPK cascade, and several bHLH transcription factors including SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA, and SCREAM (SCRM)11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Previous work indicates that one of the receptor kinases, ER-LIKE 1 (ERL1), demonstrates active subcellular behaviors upon EPF perception20. ERL2 also dynamically traffics between the plasma membrane and some intracellular organelles27. Blocking the membrane trafficking steps causes abnormal stomatal patterning, resulting in stomatal clusters on the leaf surface28. These results suggest that membrane traffic plays an essential role in stomatal development. This study describes a protocol to spatiotemporally investigate the ERL1 dynamics using protein-protein subcellular co-localization analysis combined with pharmacological treatment using some membrane trafficking inhibitors.

저자 스포트라이트: 기공 계통 세포에서 막 이동 이벤트를 연구하기 위한 이미지 기반 방법  

기공 계통 세포에서 막 트래피킹 사건을 연구하기 위한 이미지 기반 방법

This technique studies the membrane trafficking events in stomatal development, the micropores on plant aerial surface, to facilitate photosynthesis and the transpiration. Various techniques are used to study plant stomatal development. This includes molecular biology, cell biology or microscopy, chemical biology, mass spectrometry, biochemistry, and structural biology.Individual stomata form asynchronously. Each stoma is formed by three transcend cell fate transitions. So collecting enough stomata lineage cells at a particular cell fate is one of the big challenges.Membrane trafficking is essential for cell survival and growth. Stomata lineage cell is no exception. This protocol addresses the commonly used approach to study membrane trafficking events in stomata lineage cells.Plants face challenging environment in the face of climate change. Stomata are passages for plant gas exchange, and are highly flexible to environmental stress for adaptation. We are interested in studying how abiotic stress affects the stomata development by focusing on the membrane trafficking of certain proteins in stomata lineage cells.

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Sample Preparation and Confocal Imaging of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana   

Dual-Colored F1 형질전환 Arabidopsis thaliana의 시료 전처리 및 공초점 이미징

샘플 준비를 시작하려면 날카로운 면도날을 사용하여 약리학적으로 처리된 Arabidopsis thaliana 형질전환 샘플에서 진엽을 해부합니다. 유리 슬라이드에 진정한 잎을 놓고, 물 한 방울에 abaxial side가 위로 향하게합니다. 기포가없는 커버 슬립으로 진정한 잎을 천천히 덮으십시오.이미징의 경우 노란색 형광 단백질 또는 YFP 여기용 514나노미터 레이저를 선택하여 빔 경로를 설정합니다. 높은 레이저 출력을 사용하여 높은 이미지 품질을 얻을 수 있습니다. PMT 또는 HYD를 켜고 YFP 형광단의 스펙트럼을 기반으로 상한 및 하한 방출 대역 임계값을 정의합니다.YFP 신호를 수집하기 위해 530에서 570 나노미터의 감지 창을 설정합니다. 두 번째 색상의 순차적 이미지의 경우 탐색 버튼을 클릭하고 새 채널을 추가합니다. 두 번째 탐색에서 적색 형광 단백질 또는 RFP 여기용 555나노미터 레이저를 선택하고 RFP 신호를 수집하기 위해 570-630나노미터의 검출 창을 설정합니다.시스템에서 63X, 1.2W 코어 렌즈를 선택하여 기공 전구체 세포 내 세포내 세포막 트래픽 활동을 이미징합니다. 1024 x 1024 픽셀의 이미지 크기로 형식을 시작한 다음 좋은 해상도를 위해 확대/축소 비율과 목표 설정에 따라 최적화합니다. 다음으로, 400Hz의 속도로 시작하여 스캔 헤드의 속도를 설정하고 샘플의 특정 상황에 따라 이를 최적화합니다.대물 렌즈를 변경하지 않고 관심 영역을 확대하려면 확대/축소 계수를 1로 입력하고 실험의 특정 요구 사항에 따라 이를 최적화합니다. 라인 평균은 평균 결과를 얻기 위해 각 X 라인을 스캔하는 횟수를 나타냅니다. 멤브레인 트래피킹 이벤트를 이미징하기 위해 2X 라인 평균으로 시작하고 필요에 따라 최적화합니다.획득 모드에서 XYT 스캔 모드를 선택하여 시계열 유틸리티를 활성화합니다. 그런 다음 시간 간격 아래의 시점 사이의 대기 기간을 선택합니다. 프레임을 선택하여 수집할 프레임 수를 정의합니다.최대 강도 투영과 함께 Z-스택 스캔 모드를 사용하여 전체 셀 내의 멤브레인 트래피킹 이벤트에 대한 3차원 정보를 수집합니다. 그런 다음 획득 모드에서 XYZ 스캔 모드를 선택하면 Z-stack 유틸리티에 액세스할 수 있게 됩니다. Z 와이드 옵션을 선택합니다.스캔 모드에서 시작 및 끝 버튼을 사용하여 Z 스택의 상단 및 하단 이미지를 정의합니다. 그런 다음 Z 단계 크기를 클릭하여 Z 단계의 두께를 정의합니다. 이미지를 처리하려면 Confocal 소프트웨어에서 기본 프로세스 탭을 클릭합니다.맨 왼쪽의 열린 프로젝트 탭에서 관심 있는 Z 스택 파일을 선택합니다. 그런 다음 프로세스 도구라는 중간 탭에서 투영 함수를 선택합니다. 메서드의 드롭다운 패널에서 최대값을 선택하고 적용 버튼을 클릭합니다.Z-스택 투영 이미지는 열려 있는 프로젝트 탭 아래에 생성됩니다. 시계열 이미지에서 비디오를 생성하려면 피지 소프트웨어에서 파일 탭을 클릭하고 모든 시계열 이미지를 올바른 순서로 하나씩 여는 기능을 엽니다. 또는 이미지를 이미지 J로 끌어 데이터를 올바른 순서로 엽니다.그런 다음 이미지 탭에서 스택 기능을 찾고 스택할 이미지를 선택하여 비디오를 생성합니다. 완료되면 원하는 프레임 속도로 파일을 avi 형식으로 저장합니다. ERL1 프로모터 ERL1 YFP를 함유하는 7일 된 형질전환 식물의 실제 잎에서, ERL1 YFP가 원형질막을 표지하는 YFP 신호에 의해 산란된 세포가 강조되었다.다중 점상 신호도 관찰되었으며, 이는 ERL1이 엔도솜에도 국한되었음을 시사합니다. RFP Ara7은 거의 모든 세포에서 여러 점상 신호를 강조 표시하여 이러한 세포에서 다소포체 또는 MVB를 나타냅니다. RFP Ara7이 ERL1 YFP 신호와 병합되었을 때 대부분의 점액이 겹쳐져 일부 ERL1 YFP 분자가 MVB로 전달되었음을 시사합니다.ERL1 YFP 및 MVB 마커 단백질 RFP Ara7을 함유한 진엽의 시계열은 YFP 표지 엔도솜이 기공 계통 세포 내에서 RFP Ara7과 함께 이동했음을 보여주었습니다. ERL1 YFP가 다소포체에 국한된 것을 확인하였다.

Research

JoVE Journal

Biology

Sample Preparation and Confocal Imaging of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...