Name: Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-05-12T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging at JoVE.com

biological samples preparation for confocal microscopy, image acquisition setup, and confocal microscopy imaging

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells

Watch this Scientific Journal Video about Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging at JoVE.com

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging (Video) | JoVE 

Förberedelse av biologiska prover för konfokalmikroskopi, bildförvärv och konfokalmikroskopiavbildning

Börja med att blanda 200 mikroliter reducerat serummedium med två mikrogram av ett plasmid-DNA separat i ett sterilt mikrocentrifugrör. Upprepa detta för två andra plasmider i separata rör. Blanda sedan 200 mikroliter reducerat serummedium med sex mikroliter transfektionsreagens i det nya röret två och blanda innehållet genom pipettering.Inkubera rören i fem minuter vid rumstemperatur innan innehållet i rör två blandas till rör ett. I separata rör, upprepa blandningen av de andra två plasmiderna med ett transfektionsreagens. Inkubera blandningen i 20 minuter vid rumstemperatur.Lägg sedan droppvis till transfektionskomplexen i HeLa-cellodlingsfröade bildskålar, vilket säkerställer lika fördelning över hela skålen. En timme före avbildning, öppna koldioxidtankventilen och slå på miljökontrollen för mikroskopet. Använd upp- och nedpilarna på styrplattan och justera temperaturen till 37 grader Celsius och koldioxiden till 5 % Tryck på Ställ in när du är klar.För att justera laserinställningarna, slå på lasern med vitt ljus genom att klicka på fliken Hämta och välja Öppna laseröversikt. I dialogrutan växlar du den vita ljuslasern till på. Ange lasereffekt som 85%Klicka på excitationskontrollknappen och välj maximal effekt i rullgardinsmenyn.Börja tetraetylrhodaminetylesterperkolatet eller TMRE, experimentera genom att ställa in excitationslasern till 514 nanometer och emissionsspektrafönstret till 524 till 545 nanometer för YFP. Därefter, för MitoTracker Deep Red, ställ in excitationslasern på 641 och emissionsspektrafönstret på 650 till 750 nanometer. På samma sätt, för TMRE, ställ in excitationslasern på 555 nanometer och emissionsspektrafönstret på 557 till 643 nanometer.Börja inställningen för bildhämtning genom att välja fliken Förvärv och justera formatet till 1024 x 1024. Justera hastigheten till 600 i rullgardinsmenyn. Klicka sedan på Linjegenomsnitt knappen och välj tre från rullgardinsmenyn.Aktivera dubbelriktad skanning och ställ in fas- och zoomfaktorn på 22,61 respektive 1,50. När du är klar väljer du cellerna baserat på YFP-fluorescerande signal genom att klicka på YFP-inställningen och trycka på Fast Live. Justera sedan förstärkningen och intensiteten för YFP och välj sedan celler baserat på YFP-fluorescerande signal.För att avbilda DMSO-kontrollplattan i TMRE-experimentet, justera förstärkningen och intensiteten för TMRE-signalinställningen två så att mitokondriens nätverksintensitet är strax under mättnad. Håll förstärkningen och intensiteten för TMRE konstant. Justera sedan förstärkningen och intensiteten för MitoTracker-inställningen så att mitokondriellt nätverk är synligt, men svagt.När förstärknings- och intensitetsinställningarna är klara klickar du på Start för att hämta en bild. Hämta bilder av 20 celler per experimentellt tillstånd.

Research

JoVE Journal

Biology

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging

Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells (Video) | JoVE 

Fluorescensbaserad kvantifiering av mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer med hjälp av levande avbildning i HeLa-celler

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, ...

Fluorescence Intensity Quantification of Transfected HeLa Cells Using ImageJ

Fluorescence Intensity Quantification of Transfected HeLa Cells Using ImageJ (Video) | JoVE 

Fluorescensintensitetskvantifiering av transfekterade HeLa-celler med ImageJ