Name: Murine PAUSAT Imaging
Uploaded: 2023-06-02T12:20:00
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murine pausat imaging

Imaging non invasivo integrato PAUSAT dell'intero cervello dell'ictus ischemico

Blood transports oxygen (via the hemoglobin protein) and other important nutrients to tissues in our bodies. When the flow of blood through tissues is interrupted (ischemia), severe damage to the tissues can occur, the most immediate effects of which are due to a lack of oxygen (hypoxia). Ischemic stroke is the result of interrupted blood flow to a certain region of the brain. The brain damage resulting from an ischemic stroke can occur within minutes of a vessel blockage, and can often have debilitating and lasting effects1,2. A highly valuable strategy to evaluate the physiopathology after ischemic stroke and identify and test new treatments is the use of small-animal models in the lab. Treatments discovered in the lab aim to be translated to clinical use and improve patients&#39; lives. However, the use of animals in biomedical research needs to be carefully evaluated according to Russell and Burch&#8217;s 3Rs principles: replacement, reduction, and refinement3. The objective of the reduction component is to reduce the number of animals without compromising data collection. With this in mind, being able to longitudinally evaluate the lesion evolution via noninvasive imaging allows a great advantage in reducing the number of animals required, as well as maximizing the information obtained from each animal4.
Photoacoustic tomography (PAT) is a hybrid imaging modality that combines optical absorption contrast with ultrasound imaging spatial resolution5. The imaging mechanism of PAT is as follows. An excitation laser pulse is illuminated on the target being imaged. Assuming the target absorbs light at the wavelength of the excitation laser, it will increase in temperature. This quick increase in temperature results in a thermoelastic expansion of the target. The expansion causes an ultrasound wave to propagate out from the target. By detecting the ultrasound wave at many positions, the time required for the wave to propagate from the target to the detectors can be used to create an image through a reconstruction algorithm. The ability of PAT to detect optical absorption in deep tissue regions differentiates PAT from ultrasound imaging, which detects boundaries of differing acoustic impedances of tissues5. In the visible and near-infrared spectra, the primary highly absorbing biomolecules that are abundant in organisms are hemoglobin, lipids, melanin, and water7. Of particular interest in the study of stroke is hemoglobin. Since oxyhemoglobin and deoxyhemoglobin have different optical absorption spectra, PAT can be used with multiple excitation laser wavelengths to determine the relative concentration of the two states of the protein. This allows the oxygen saturation of hemoglobin (sO2), or blood oxygenation, to be quantified in and outside of the infarct region8,9. This is an important measure in ischemic stroke, as it can indicate the level of oxygen in the damaged brain tissue following ischemia.
Acoustic angiography (AA) is a contrast-enhanced ultrasound imaging method that is particularly useful for imaging the morphology of vasculature in vivo10. The method relies on the use of a dual-element wobbler transducer (a low frequency element and a high frequency element) in conjunction with microbubbles injected into the circulatory system of the imaging subject. The low-frequency element of the transducer is used for transmitting at the resonant frequency of the microbubbles (e.g., 2 MHz), while the high-frequency element is used to receive the super harmonic signals of the microbubbles (e.g., 26&#160;MHz). When excited at a resonant frequency, the microbubbles have a strong nonlinear response, resulting in the production of super harmonic signals that surrounding body tissues do not produce11. By receiving with a high-frequency element, this ensures that only the microbubble signals are detected. Since the microbubbles are confined to the blood vessels, the result is an angiographic image of blood vessel morphology. AA is a powerful method for imaging ischemic stroke, as the microbubbles that flow through the circulatory system are not be able to flow through blocked vessels. This allows AA to detect regions of the brain that are not perfused due to ischemic stroke, which indicates the infarct region.
Preclinical ischemic stroke research generally relies on the use of histology and behavioral testing to assess the location and severity of the stroke. Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining is a common histological analysis used to determine the stroke infarct volume. However, it can only be used at an endpoint, since it requires the animal to be euthanized12. Behavioral tests can be used to determine motor function impairment at multiple time points, but they cannot provide quantitative anatomical or physiological values13. Biomedical imaging provides a more quantitative approach to studying the effects of ischemic stroke noninvasively and longitudinally9,14,15. However, existing imaging technologies (such as small-animal magnetic resonance imaging [MRI]) can come at a high cost, be unable to provide concurrent structural and functional information, or have limited penetration depth (as most optical imaging techniques).
Here, we combine photoacoustic, ultrasound, and angiographic tomography (PAUSAT; see system diagram in Figure 1), which allows for complementary structural and functional information of blood perfusion and oxygenation following ischemic stroke16. These are two important aspects in assessing the severity of injury and monitoring the recovery or response to treatments. Using these integrated imaging methods can increase the amount of information obtained by each animal, reducing the number of animals required and providing more information in the study of potential treatments for ischemic stroke.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65319/65319fig01.jpg" /> 
Figure 1: PAUSAT diagram. (A) Complete schematic of the PAUSAT system, including the laser and OPO used for PAT. (B) Inside view of the PAUSAT system, including two ultrasound transducers. The dual-element wobbler transducer is used for both B-mode ultrasound and AA, and the linear-array transducer is used for PAT. Both transducers are mounted on the same 2D motorized stage, allowing for scanning to generate volumetric data. This figure has been modified from16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65319/65319fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Autore in primo piano: Tomografia fotoacustica, ecografica e angiografica integrata (PAUSAT) per l'imaging non invasivo dell'intero cervello dell'ictus ischemico  

Tomografia fotoacustica, ecografica e angiografica integrata (PAUSAT) per l'imaging non invasivo dell'intero cervello dell'ictus ischemico

There are a few experimental challenges. For example, the presence of hair in the scalp can cause artifact in the acquired images. The age of the animal also plays a key role since the thickness of the skull is currently a limitation for the detection of deeper signals.Many purely optical imaging techniques require an invasive procedure and can only image about one millimeter deep. With PAUSAT, we combine the advantages of both ultrasound and optical imaging. We can get both structural and functional information surrounding ischemic stroke in a completely safe and non-invasive way.Being able to evaluate the evolution of an injury with or without treatment from the same animal at different time points allows us to collect very valuable information. And also to reduce the number of animals required for different studies. We are constantly working on ways to improve the imaging speed, depth, resolution and contrast for both photoacoustic and ultrasound imaging.With better imaging systems, we can answer more fundamental biological questions and evaluate new experimental treatments.

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Murine PAUSAT Imaging  

Per configurare il sistema di imaging, iniziare lasciando il laser a 532 nanometri acceso per 15 minuti per riscaldarsi. Quindi, posizionare una rampa personalizzata collegata a un palco regolabile manualmente accanto alla membrana di imaging. Collegare un supporto per denti di mouse con un tubo di respirazione collegato alla rampa e fissare una piastra riscaldante sulla superficie della rampa.Una volta che il laser si è riscaldato, posizionare una scheda del rilevatore IR vicino all'ingresso del fascio di fibre e controllare l'allineamento del laser assicurandosi che la luce laser entri nel fascio. Inizia la preparazione degli animali tagliando i capelli della testa del topo anestetizzato con un rasoio elettrico da vicino agli occhi a dietro le orecchie. Applicare una crema depilatoria sulla parte superiore della testa.Dopo averlo lasciato in posa per cinque minuti, pulire la crema con un batuffolo di cotone bagnato. Ripetere l'applicazione fino a quando la pelle della testa è completamente depilata. Poco prima di trasferire l'animale sulla piattaforma del sistema, utilizzare un ago calibro 27 per iniettare retroorbitalmente 100 microlitri di microbolle a concentrazione di stock.Ora, metti una goccia della lozione protettiva per gli occhi sugli occhi. Avviare l'imaging PAUSAT riempiendo la finestra di imaging con acqua distillata sulla superficie per l'accoppiamento acustico. Quindi, fissare la testa del mouse nel supporto del dente e garantire una corretta anestesia e flusso d'aria.Utilizzando una lampada riscaldante e una sonda rettale collegata a un regolatore di temperatura, mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37 gradi Celsius. Aprire l'applicazione di imaging e passare all'ecografia in modalità B. Utilizzare la finestra ecografica dal vivo per regolare manualmente la testa del mouse nella posizione desiderata e l'altezza del palco di conseguenza.Regolare il valore della frequenza di trasmissione degli ultrasuoni in modalità B a 16 megahertz. Quindi, immettere le informazioni della directory di salvataggio nell'applicazione di imaging. Quindi, selezionare la regione desiderata della scansione cerebrale utilizzando la casella mobile.Premere il pulsante Acquisisci statico e controllare i risultati della scansione una volta completata l'acquisizione dell'immagine per garantire l'imaging della regione desiderata. Per eseguire l'angiografia acustica, tornare a Acquisizione immagini, quindi cambiare la modalità in Angiografia acustica. Quindi, immettere i parametri del protocollo di scansione desiderati, impostando la spaziatura dei fotogrammi su 0,2 millimetri e 10 fotogrammi per posizione.Controllare i risultati della scansione sotto l'analisi delle immagini per garantire la qualità dell'immagine. Per visualizzare con la tomografia fotoacustica, aprire l'oscillatore parametrico ottico o l'applicazione OPO e impostarlo su 756 nanometri. Quindi, traslare manualmente il trasduttore ad array lineare nelle coordinate determinate in precedenza per co-registrare automaticamente i volumi wobbler e i volumi dell'array lineare.Aprire l'applicazione laser e accendere il laser a 532 nanometri. Impostare i parametri di scansione come dimensioni del passo di 0,4 millimetri, lunghezza di scansione di 20 millimetri e media di 10 fotogrammi per posizione. Ora, apri il programma MATLAB del sistema di acquisizione dati a ultrasuoni e premi il pulsante Esegui.Quindi, premere start nell'applicazione di scansione. Una volta completata la scansione, apri il programma di salvataggio MATLAB. Modificare il nome di salvataggio con il nome del file desiderato e premere Esegui.Quindi modificare la lunghezza d'onda OPO a 798 nanometri e ripetere la scansione. L'angiografia acustica, o imaging AA, ha mostrato che nel cervello illeso, entrambi gli emisferi presentano una distribuzione simile dei vasi sanguigni. Risultati simili si osservano nelle immagini fotoacustiche a due diverse lunghezze d'onda.Una notevole riduzione del segnale nella corteccia laterale destra è stata osservata nelle immagini AA di topi elettrocauterizzati. La stessa regione ha anche mostrato una ridotta ossigenazione dei tessuti che suggerisce ischemia. L'imaging PAUSAT può identificare le aree dell'ictus sulla base del modello di ictus trombotico fotografico, identificando la regione della corteccia superiore con ridotto apporto di flusso sanguigno e ridotta saturazione di ossigeno.L'età del topo può influenzare l'imaging poiché il cranio diventa più spesso e si traduce in una diversa impedenza acustica con conseguente diminuzione della profondità dell'immagine per i topi più anziani.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Integrated Photoacoustic, Ultrasound, and Angiographic Tomography (PAUSAT) for NonInvasive Whole-Brain Imaging of Ischemic Stroke

Presented here is an experimental ischemic stroke study using our newly developed noninvasive imaging system that integrates three acoustic-based imaging ...