لإصابة فلقات فول الصويا بجذور Agrobacterium ، صمم مواد أولية للكشف عن جين البلازميد TI virD2 باستخدام تسلسل جذور Agrobacterium PRI2659 البلازميد. بعد التحول ، اختبر مستعمرات Agrobacterium للاحتفاظ ب virD2 بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعة PCR. بعد اختيار مستعمرات Agrobacterium rhizogenes التي تحتوي على كل من virD2 والجين محل الاهتمام ، قم بخط بعض المستعمرات على ألواح LB التي تحتوي على 100 ملليغرام لكل لتر من سبكتينومايسين للبلازميد محل الاهتمام.
في اليوم التالي ، باستخدام طرف ماصة P200 ، اكشط طول 1.5 سم من Agrobacterium من لوحة LB وأعد تعليقه في ملليلتر واحد من محلول الفوسفات. تمييع تعليق الخلية المعاد تعليقها والمياه عالية النقاء المعقمة في الأسيتوسيرينغون. قم بقياس الامتصاص باستخدام أنبوب كوفيت بكثافة بصرية تبلغ 600 نانومتر.
بعد ذلك ، في خزانة السلامة الحيوية ، اغمس مشرطا معقم في محلول Agrobacterium وقم بعمل قطع بعمق ملليمتر واحد على طول السطح الداخلي للنبتة. ضع ستة إلى ثمانية فلقات مقطوعة الجانب لأسفل على طبق بتري يحتوي على ورق ترشيح مشبع بالإنبات ووسط الزراعة مع الأسيتوسيرينجون. احتضان الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاثة أيام تحت فترة تصوير مدتها 16 ساعة.
بعد ثلاثة أيام ، انقل النبتات المصابة إلى نمو جذر مشعر ، أو ألواح HRG. احتضان الصفائح في غرف النمو المحددة على 22 درجة مئوية وشدة ضوء 100 ميكرومول في فترة تصوير مدتها 16 ساعة حتى تلاحظ الجذور الأولية ذات الجذور الثانوية التي يتراوح طولها بين 2 و 3 سنتيمترات. بعد ثلاثة إلى أربعة أسابيع ، احصد الجذور الأولية التي تنمو من الكالس وتحتوي على جذور ثانوية باستخدام مشرط وملقط معقمين.
نقل الجذور إلى لوحات HRG مختارة تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة والسماح لها بالنمو لمدة خمسة أيام إضافية. في اليوم الخامس ، احصد الجذور المشعرة المعدلة وراثيا ذات الجذور الثانوية التي يبلغ طولها من ثلاثة إلى ستة سنتيمترات. في حالة مراقبة البروتينات الفلورية ، تأكد من أن الجذور الثانوية لديها القليل من التألق الذاتي.
بعد ذلك ، لإجراء الاستنباط أو المعالجات الكيميائية ، قم بتقطيع الجذور الثانوية إلى قطع سنتيمتر واحد ووضع حوالي 100 ملليغرام على أجار HRG في كومة. ثم تشبع الكومة ب 80 ميكرولتر من محلول المعالجة المناسب واترك اللوحة تحضن في درجة حرارة الغرفة. بعد 24 ساعة ، لاستخراج الحمض النووي الريبي ، جفف الجذور بسرعة على منشفة ورقية معقمة وحصادها مباشرة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 ملليلتر.
أغلق الجزء العلوي من الأنبوب على الفور باستخدام parafilm وقم بعمل فتحتين صغيرتين باستخدام ملقط مدبب. يتم عرض نتائج مستعمرة PCR من Agrobacterium المحولة. أشارت المستعمرات الإيجابية في تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى الجين محل الاهتمام.
ومع ذلك ، كان ثلث إلى نصف المستعمرات سلبيا لفحص الجينات virD2. يوضح الفحص المجهري الفلوري التوطين تحت الخلوي ل GFP-GmJAZ1-6. أكد تحليل التعبير الجيني الإفراط في التعبير عن عامل نسخ الجلسولين GmHSF6-1 وإسكات الحمض النووي الريبي ل GmMYB2912 في جذور هاري ويليامز 82.
