Name: Optogenetic Stimulation, Laser Ablation, and Imaging of Drosophila Embryos (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-04-14T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Stimulation, Laser Ablation, and Imaging of Drosophila Embryos at JoVE.com

optogenetic stimulation, laser ablation, and imaging of drosophila embryos

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Stimulation, Laser Ablation, and Imaging of Drosophila Embryos at JoVE.com

Optogenetic Stimulation, Laser Ablation, and Imaging of Drosophila Embryos (Video) | JoVE 

Optogenetische stimulatie, laserablatie en beeldvorming van Drosophila-embryo's

Doe om te beginnen het kamerlicht uit. Selecteer Oculair onder het oculair paneel in de FlowView software. Verander de kubuskoepel in vier TRITC en schakel de aanraakpaneelcontroller uit door onder achtergrondverlichting van de aanraakpaneelcontroller in de software uit te klikken.Schakel vervolgens het computerscherm uit. Open de voorkant van de zwarte doekkap op de microscoop. Neem de schaal met glazen bodem van 35 millimeter met de embryo's uit de zwarte doos en plaats deze op het microscoopstadium.Schakel vervolgens de fluorescentieverlichtingseenheid in en gebruik het oculair om het embryo van belang te identificeren. Breng het in beeld. Sluit het zwarte doekdeksel om het monster tegen licht te beschermen.Schakel het computerscherm in om toegang te krijgen tot de software die de microscoop bestuurt. Verander het oculair in LSM in de software voor beeldacquisitie. Voer laserablatie uit in controle van niet-gestimuleerde embryo's met behulp van een 25-voudige vergrotingswateronderdompelingsobjectief.Klik op Bright Z, Sequence Manager en LSM-stimulatie in het gereedschapsvenster. Stel het scannertype in op Galvano en de scangrootte op 512 bij 512. Schakel kanaal één en kanaal drie onder het PMT-instellingenpaneel in om het gebruik van de 1040 nanometer laser mogelijk te maken en klik vier keer zo snel live om het embryo te visualiseren.Roteer het embryo met behulp van de rotatiefunctie om de voorste achterste as verticaal georiënteerd te maken en stel de zoom in op drie. Teken een interessegebied of ROI met het gereedschap Vorm onder Scaninstellingen en stel de ROI-grootte in het referentievenster in. Stel vervolgens de ROI in op 512 pixels in de breedte en 100 pixels in de hoogte.Om de acquisitieparameters voor de pre-ablatie Z-stack in te stellen, registreert u het oppervlak van het embryo als nul onder de Z-sectie. Stel het begin in op nul en het einde op 100 micrometer. Stel de stapgrootte in als twee micrometer en activeer de Z-acquisitiemodus door Z aan te vinken op het tabblad Serie.Stel met behulp van de heldere Z-functie de laserintensiteit van 1040 nanometer in om lineair te verhogen van 3% naar 7%Sla de huidige beeldinstelling op als de eerste taak van de pijplijn door op LSM te klikken in Sequentiebeheer. Om acquisitieparameters voor de pre-ablatiefilm in te stellen, stelt u een ROI in van 512 bij 512 pixels in de buurt van het ventrale oppervlak van het embryo, zoals eerder is aangetoond. Stel de laserintensiteit van 1.040 nanometer in op 3% Controletijd en schakel Z uit onder het seriepaneel.Houd het interval als vrije uitvoering onder het time-lapsepaneel en stel de cyclus in op 10. Sla de huidige instelling op als de volgende taak van de pijplijn door te klikken op LSM in Sequentiebeheer. Om de parameters voor laserablatie in te stellen, definieert u een 3D-gebied direct onder het vitelline-membraan.Stel het begin van de Z-stack in als het vlak en het einde als 20 micrometer dieper. Stel de stapgrootte in op 1,5 micrometer. Schakel kanaal twee en kanaal vier onder het PMT-instellingenpaneel in om het gebruik van de 920 nanometer laser mogelijk te maken.Stel de intensiteit van de laser in op 30% en stel de beeldacquisitie met de laser in voor een enkele Z-stack binnen het gedefinieerde 3D-gebied. Sla de huidige instelling op als de volgende taak van de pijplijn door te klikken op LSM in Sequentiebeheer. Als u acquisitieparameters voor de postablatiefilm wilt instellen, stelt u beeldacquisitie in voor een 100-frame single Z-vlak-postablatiefilm met behulp van de lasers van 1, 040 en 920 nanometer.Stel de intensiteit van de lasers in op 3% en 0,3%Sla de huidige instelling op als de volgende taak van de pijplijn door op LSM te klikken in Sequentiebeheer. Selecteer volgorde onder acquire. Wijzig indien nodig het pad voor het opslaan van gegevens en de bestandsnaam.Klik op Gereed, wacht tot de software de pijplijn heeft geïnitialiseerd en klik vervolgens op Start om de pijplijn uit te voeren. om laserablatie uit te voeren in gestimuleerde embryo's, Stel acquisitieparameters in voor de pre-ablatie Z-stack zoals aangetoond voor de niet-gestimuleerde embryo's. Sla de huidige instelling op als de eerste taak van de pijplijn door te klikken op LSM in Sequentiebeheer.Als u parameters voor optogenetische stimulatie wilt instellen binnen een gedefinieerde ROI, wijzigt u de zoom in één en selecteert u een ROI die het ventrale oppervlak van het embryo bedekt. Schakel het kanaal één uit om vier detectoren te kanaliseren, klik op LSM-stimulatie, schakel continu binnen de duur uit en typ 12 seconden. Sla de huidige instelling op als de volgende taak van de pijplijn door op stimulatie te klikken in Sequentiebeheer.Stel een wachttijd van drie minuten in na stimulatie om totale inactivatie van myosine en apicale F-actinedemontage te garanderen en een statische weefselmorfologie te bereiken vóór laserablatie. Stel vervolgens acquisitieparameters in voor de enkele Z-vlak pre-ablatiefilm zoals gedemonstreerd voor de niet-gestimuleerde embryo's, behalve dat de lasers van 1, 040 en 920 nanometer worden gebruikt voor beeldacquisitie. Schakel het kanaal één in om vier detectoren te kanaliseren.Stel de intensiteit van de lasers in op 3% en 0,3%Sla de huidige instelling op als de volgende taak van de pijplijn door op LSM te klikken in Sequentiebeheer. Stel parameters in voor laserablatie zoals aangetoond voor de niet-gestimuleerde embryo's. Sla de huidige instelling op als de volgende taak van de pijplijn door te klikken op LSM in Sequentiebeheer.Stel acquisitieparameters in voor de enkele Z-vlak post-ablatiefilm zoals gedemonstreerd voor de niet-gestimuleerde embryo's. Sla de huidige instelling op als de volgende taak van de pijplijn door te klikken op LSM in Sequentiebeheer. Selecteer volgorde onder acquire.Wijzig indien nodig het pad voor het opslaan van gegevens en de bestandsnaam. Klik op Gereed en wacht tot de software de pijplijn heeft geïnitialiseerd en klik vervolgens op Start om de pijplijn uit te voeren. In de niet-gestimuleerde embryo's die apicale vernauwing ondergingen, werd spaghettipompoen mCherry verrijkt in het mediale apicale gebied, terwijl CRY2Rho een dominante negatieve mCherry cytosolisch was.In de gestimuleerde embryo's werd het CRY2Rho één dominant negatief mCherry-signaal plasmamembraan gelokaliseerd, terwijl het mediale apicale signaal van spaghettipompoen mCherry volledig verdween. Laserablatie van de niet-gestimuleerde embryo's binnen het vernauwingsdomein leidde tot een snelle weefselterugslag langs de voorste achterste as, terwijl laserablatie in de gestimuleerde embryo's niet resulteerde in merkbare weefselterugslag. De ablatie werd gekwantificeerd en hier getoond.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optogenetic Stimulation, Laser Ablation, and Imaging of Drosophila Embryos

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility in Drosophila

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos (Video) | JoVE 

Optogenetische remming van Rho1-gemedieerde actomyosinecontractiliteit in combinatie met meting van epitheliale spanning in Drosophila-embryo's

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

Collection of Drosophila Embryos and Preparing Them for Optogenetic Stimulation

Collection of Drosophila Embryos and Preparing Them for Optogenetic Stimulation (Video) | JoVE 

Verzameling van Drosophila-embryo's en voorbereiding op optogenetische stimulatie