Para começar, prepare o experimento e o material necessário para a montagem e posicionamento do peixe-zebra. Sob um microscópio estéreo, observe a larva de peixe-zebra paralisada para verificar se seu movimento parou. Avalie visualmente a saúde da larva, verificando seus batimentos cardíacos.
Em seguida, usando uma pipeta de transferência, coloque uma única larva de peixe-zebra no tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo gel de agarose. Despeje o gel de agarose na placa de Petri para fazer uma camada de um a dois milímetros. Transfira a larva do tubo de microcentrífuga para a placa de Petri usando uma pipeta de transferência.
Certifique-se de colocar a larva no centro do prato. Usando pinças, posicione a larva na orientação desejada para que a cabeça e a cauda fiquem planas. Em seguida, usando pinças, gire a larva para nivelar os dois olhos.
Depois que o alinhamento estiver completo, espere até que o gel de agarose tenha solidificado antes de encher a placa de Petri com água de ovo. Coloque a placa com a larva embebida no palco do microscópio para aquisição da imagem. Ligue o microscópio e localize a larva no centro do campo de visão.
Usando o software de aquisição de imagens, defina os parâmetros de imagem. Se a imagem estiver saturada, reduza a potência do laser. Em seguida, encontre o cérebro da larva movendo o palco e determine sua espessura usando o modo Live View no software, alterando os planos focais manualmente para cima e para baixo.
Defina os limites inferior e superior do volume. Em seguida, prossiga com a aquisição da imagem para o campo de visão definido. Para imagens estruturais volumétricas, adquira uma imagem 3D de todo o cérebro obtendo imagens 2D de cada plano Z sequencialmente.
Para imagens funcionais de um único plano Z, adquira imagens de séries temporais da atividade neuronal do cérebro em uma determinada profundidade.
