Name: Testing the Polarized State of Mitochondria to Analyze the Ion Channel Function in Cancer Cells (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Testing the Polarized State of Mitochondria to Analyze the Ion Channel Function in Cancer Cells at JoVE.com

testing the polarized state of mitochondria to analyze the ion channel function in cancer cells

Screening Ion Channels in Cancer Cells

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Testing the Polarized State of Mitochondria to Analyze the Ion Channel Function in Cancer Cells  (Video) | JoVE 

कैंसर कोशिकाओं में आयन चैनल फ़ंक्शन का विश्लेषण करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया की ध्रुवीकृत स्थिति का परीक्षण 

शुरू करने के लिए, 75-वर्ग सेंटीमीटर कल्चर फ्लास्क में कोशिकाओं को बनाए रखें। कल्चर माध्यम को एस्पिरेट करें और कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना पीबीएस के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें। इसके बाद, पालन कोशिकाओं को अलग करने के लिए 0.25% ट्रिप्सिन ईडीटीए के दो मिलीलीटर जोड़ें।कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और 10 मिलीलीटर मध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। इसके बाद, फ्लास्क से कोशिकाओं को 15-मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें। कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 480 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और माध्यम को एस्पिरेट करें।संस्कृति के मूल संयोजन के आधार पर 5 से 10 मिलीलीटर माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। 100 माइक्रोलीटर कोशिकाओं को निकालें और 0.4% ट्राइपैन ब्लू के 100 माइक्रोलीटर के साथ 1.5-मिलीलीटर ट्यूब में जोड़ें। कोशिकाओं को हेमोसाइटोमीटर में जोड़ें, और माइक्रोस्कोप के नीचे अवलोकन करके और मैनुअल टैली काउंटर का उपयोग करके उन्हें गिनें।फिनोल लाल के बिना कल्चर माध्यम में कोशिकाओं को तीन गुना 10 से चौथी कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर तक पतला करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार पॉली-डी-लाइसिन-लेपित कवर स्लिप के साथ छह-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल सस्पेंशन के 2.5 मिलीलीटर जोड़ें। कोशिकाओं को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में विकसित करें ताकि कवर स्लिप में सेल अटैचमेंट को सक्षम किया जा सके।अगले दिन, 20X उद्देश्य का उपयोग करके एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत सेल अटैचमेंट की जांच करें। वांछित सांद्रता पर उपचार स्टॉक समाधान तैयार करें और मीडिया-केवल नियंत्रण बनाएं, एक एकाग्रता पर एक वाहन-केवल नियंत्रण जो परीक्षण यौगिक से मेल खाता है, और आयोनोफोर एफसीसीपी और परीक्षण यौगिकों के साथ एक नियंत्रण। एक समय में एक कवर स्लिप के साथ काम करते हुए, कोशिकाओं में अध्ययन के तहत स्थिति के लिए 1.8 मिलीलीटर मध्यम जोड़ें।वांछित समय के लिए एक ह्यूमिडिफायर वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर नियंत्रण या परीक्षण यौगिक के साथ इलाज की गई कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। उपचार अवधि के बाद, कोशिकाओं में 10एक्स टीएमआरई के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। 5% कार्बन डाइऑक्साइड ह्यूमिडिफायर वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 से 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।धीरे से माध्यम को एस्पिरेट करें और पृष्ठभूमि हस्तक्षेप को कम करने के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार कुल्ला करें। फिर कवर स्लिप को उपचार की स्थिति के साथ लेबल किए गए माइक्रोस्कोप स्लाइड पर घुमाएं। कोशिकाएं 549 नैनोमीटर उत्तेजना और 575 नैनोमीटर उत्सर्जन पर रहती हैं।सेल अखंडता खोने से पहले उच्च गति छवि कैप्चर के साथ कई जेड-स्टैक क्षेत्रों को पकड़ने के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। बाद के विश्लेषण के लिए छवि फ़ाइल को सहेजें और संग्रहीत करें। सक्रिय माइटोकॉन्ड्रिया वाली कोशिकाओं ने टीएमआरई धुंधला बनाए रखा और उच्च प्रतिदीप्ति दिखाई।विध्रुवीकृत या निष्क्रिय माइटोकॉन्ड्रिया ने झिल्ली क्षमता को कम कर दिया है, टीएमआरई को बनाए रखने में विफल रहता है, और कम प्रतिदीप्ति संकेत दिखाता है।

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