Name: Recombinant Vescicle Isolation from Bacterial Culture to Release Soluble Protein (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-30T12:50:00
Duration: 2 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Recombinant Vescicle Isolation from Bacterial Culture to Release Soluble Protein at JoVE.com

recombinant vescicle isolation from bacterial culture to release soluble protein

Optimized Production and Analysis of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

Watch this Scientific Journal Video about Recombinant Vescicle Isolation from Bacterial Culture to Release Soluble Protein at JoVE.com

Recombinant Vescicle Isolation from Bacterial Culture to Release Soluble Protein (Video) | JoVE 

Rekombinant vesikkelisolasjon fra bakteriekultur for å frigjøre løselig protein

Etter kloning av vesikkelnukleerende peptid, eller VNP-sekvenskode, ved aminoterminalen til fusjonsproteinet, kultur en fem milliliter lysogen buljong, eller LB-startere, fra friske bakterielle transformasjoner ved 37 grader Celsius til metning. Deretter bruker du det til å inokulere 25 ml fantastisk buljong, eller TB, som inneholder passende antibiotikavalg i en 500 milliliter konisk kolbe. Inkuber kolben i en inkubator ved 37 grader Celsius mens du rister ved 200 rotasjoner per minutt eller større enn lik et 25 millimeter orbitalkast til kulturen når en 600 nanometer optisk tetthetsverdi, eller OD 600, på 0, 8 til 1, 0.Deretter induserer rekombinant proteinuttrykk fra T7-promotoren ved å tilsette IPTG til en endelig konsentrasjon på opptil 20 mikrogram per milliliter eller 84 mikromolar. Etter å ha gitt tilstrekkelig tid til induksjon, pellet cellene ved sentrifugering ved 3000 G ved 4 grader Celsius i 20 minutter. Før supernatanten gjennom et sterilt og vaskemiddelfritt 0,45 mikron PES-filter for å sterilisere vesikkelen som inneholder medier for langtidsoppbevaring.For å konsentrere vesiklene i et mindre volum, pass den sterile vesikkelen som inneholder media gjennom et sterilt og vaskemiddelfritt 0,1 mikron MCE-filter. Deretter vasker du forsiktig membranen med 0,5 til 1 milliliter steril fosfatbufret saltvann, eller PBS, og bruk en celleskrape eller plastspreder for å fjerne vesikler forsiktig fra membranen. Overfør vesikkelkonsentratet til et nytt mikrosentrifugerør ved hjelp av en pipette.Rensede vesikler kan lagres ved fire grader Celsius. Sonikere proteinholdige vesikler i sterile medier ved hjelp av en passende tidsplan for å forstyrre vesikulære lipidmembraner og frigjøre protein. Sentrifuge den sonikerte suspensjonen ved 39.000 g og 4 grader Celsius i 20 minutter for å fjerne vesikulært rusk.BL21DE3 Escherichia coli som inneholder VNp6-mNeongreen uttrykkskonstruksjon viste at mNeongreen fluorescens ble indusert over natten med IPTG. Fluorescensen forblir synlig i kulturen etter fjerning av bakterieceller ved sentrifugering. Tilstedeværelsen av VNp-mNeongreen i kulturen i ryddet kultur media ble bekreftet av natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese.De resuspenderte rensede vesiklene i PBS viste også fluorescens.

Research

JoVE Journal

Biology

Recombinant Vescicle Isolation from Bacterial Culture to Release Soluble Protein

Production and Imaging of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

The Production of Recombinant Proteins (Video) | JoVE

Optimalisert produksjon og analyse av rekombinante proteinfylte vesikler fra E. coli

This innovative system, using a short peptide tag, that exports multiple recombinant proteins in membrane bound vesicles from E. coli, provides an ...

Visualizing Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli by Fluorescence Microscopy

Visualizing Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli by Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE 

Visualisering av rekombinante proteinfylte vesikler fra E. coli ved fluorescensmikroskopi