Name: Recombinant Vescicle Isolation from Bacterial Culture to Release Soluble Protein (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-30T12:50:00
Duration: 2 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Recombinant Vescicle Isolation from Bacterial Culture to Release Soluble Protein at JoVE.com

recombinant vescicle isolation from bacterial culture to release soluble protein

Optimized Production and Analysis of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

Watch this Scientific Journal Video about Recombinant Vescicle Isolation from Bacterial Culture to Release Soluble Protein at JoVE.com

Recombinant Vescicle Isolation from Bacterial Culture to Release Soluble Protein (Video) | JoVE 

Çözünür Proteini Serbest Bırakmak için Bakteriyel Kültürden Rekombinant Vezikül İzolasyonu

Vezikül çekirdeklendirici peptidi veya VNP sekans etiketini füzyon proteininin amino terminalinde klonladıktan sonra, 37 santigrat derecede taze bakteriyel dönüşümlerden doygunluğa kadar beş mililitrelik bir lizojeni suyu veya LB başlatıcıları kültürleyin. Daha sonra, 500 mililitrelik bir konik şişede uygun antibiyotik seçimi içeren 25 mililitre müthiş et suyu veya TB'yi aşılamak için bunu kullanın. Şişeyi bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe ederken, dakikada 200 dönüşte sallayın veya kültür 600 nanometre optik yoğunluk değerine veya OD 600'e 0,8 ila 1,0 arasında ulaşana kadar 25 milimetrelik bir yörünge atışına eşit olandan daha fazla sallayın.Daha sonra, IPTG'yi mililitre başına 20 mikrograma veya 84 mikromolara kadar nihai konsantrasyona ekleyerek T7 promotöründen rekombinant protein ekspresyonunu indükleyin. İndüksiyon için yeterli süre tanıdıktan sonra, hücreleri 20 dakika boyunca 4 santigrat derecede 3000 G'de santrifüjleme ile pelet yapın. Vezikül içeren ortamı uzun süreli depolama için sterilize etmek üzere süpernatantı steril ve deterjansız 0,45 mikron PES filtreden geçirin.Vezikülleri daha küçük bir hacme konsantre etmek için, steril vezikül içeren ortamı steril ve deterjansız 0,1 mikron MCE filtreden geçirin. Ardından, membranı 0,5 ila 1 mililitre steril fosfat tamponlu salin veya PBS ile nazikçe yıkayın ve vezikülleri membrandan dikkatlice çıkarmak için bir hücre kazıyıcı veya plastik yayıcı kullanın. Vezikül konsantresini pipet kullanarak taze bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.Saflaştırılmış veziküller dört santigrat derecede saklanabilir. Veziküler lipit membranlarını bozmak ve proteini serbest bırakmak için uygun bir program kullanarak steril ortamda vezikül içeren proteini sonikleştirin. Veziküler kalıntıları gidermek için sonikasyonlu süspansiyonu 39, 000 G ve 4 santigrat derecede 20 dakika boyunca santrifüj edin.BL21DE3 VNp6-mNeongreen ekspresyon yapısını içeren Escherichia coli, IPTG ile bir gecede indüklenen mNeongreen floresansını gösterdi. Floresan, bakteri hücrelerinin santrifüjleme yoluyla uzaklaştırılmasından sonra kültürde görünür kalmıştır. Berrak kültür ortamındaki kültürde VNp-mNeongreen'in varlığı, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi ile doğrulandı.PBS'deki yeniden askıya alınmış saflaştırılmış veziküller de floresan gösterdi.

Research

JoVE Journal

Biology

Recombinant Vescicle Isolation from Bacterial Culture to Release Soluble Protein

Production and Imaging of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

The Production of Recombinant Proteins (Video) | JoVE

E. coli'den Rekombinant Protein Dolu Veziküllerin Optimize Edilmiş Üretimi ve Analizi

This innovative system, using a short peptide tag, that exports multiple recombinant proteins in membrane bound vesicles from E. coli, provides an ...

Visualizing Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli by Fluorescence Microscopy

Visualizing Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli by Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE 

E. coli'den Rekombinant Protein Dolu Veziküllerin Floresan Mikroskobu ile Görselleştirilmesi