Для начала возьмите гранулы GFP-HUVEC, выращенные до уровня конфлюенции от 80 до 100%, и ресуспендируйте клетки в соответствующем объеме базальной среды до концентрации от 10 до 10 до 7 клеток на миллилитр исходного раствора. Приготовьте 50-миллилитровые конические центрифужные пробирки, содержащие необходимый объем базальной среды с добавлением соответствующих факторов роста. Добавьте GFP-HUVECs из исходного раствора в разведении от одного до 66,67 для достижения концентрации 1,5 умножить на 10 к пятым клеткам на микролитр.
Затем аспирируйте среду из планшета, содержащего стромальную монокультуру, и добавьте 200 микролитров в лунку приготовленной суспензии GFP-HUVECS. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе в увлажненной атмосфере, меняя среду каждые три-четыре дня. Контролируйте развитие культуры с помощью светлопольной и флуоресцентной микроскопии с использованием пятикратного объектива.
Различия между культурами можно было наблюдать по светлопольным и флуоресцентным изображениям, показывающим только GFP-HUVECs. Культуры оказались менее развитыми без какого-либо фактора роста, однако более быстрое развитие наблюдалось в присутствии FGF-2. Напротив, на светлопольных снимках были видны наиболее плотные культуры в присутствии БМП-2.
Однако сосудоподобные сети формировались как в условиях, содержащих фактор роста, так и в наиболее обширных и взаимосвязанных сетях с FGF-2.
