Na het vaststellen van de stromale endotheelcelcocultuur, verkrijgt u het GFP-signaal van de GFP-huvec met behulp van fluorescentiemicroscopie met instellingen die geschikt zijn voor kwantificering. Verwerk alle afbeeldingen die op dezelfde dag zijn verkregen vooraf om het contrast verder te verbeteren. Als u fiji of afbeelding J gebruikt, opent u alle verbeterde GFP-kanaalafbeeldingen op hetzelfde tijdstip en opent u het menu helderheid en contrast.
Selecteer een afbeelding die een tussenliggende voorwaarde vertegenwoordigt en pas het contrast automatisch aan door automatisch te selecteren. Klik op instellen en vink doorgeven naar alle andere geopende afbeeldingen aan. Beoordeel visueel of het automatisch geselecteerde bereik geschikt is voor alle afbeeldingen van het huidige tijdstip.
Indien nodig kunt u het bereik handmatig aanpassen en opnieuw doorgeven aan alle afbeeldingen en de aangepaste afbeeldingen opslaan als TIFF-bestanden. Pas vervolgens een filter voor mediane vervaging toe op alle afbeeldingen. Verklein de grootte door ze in te binnen en sla ze op als grijsschaal RGB-kleuren-TIFF-bestanden in een map voor kwantificering.
Dit kan handmatig of in batchmodus worden gedaan met behulp van macro's. Analyseer alle gemaakte afbeeldingen met behulp van de batchprocesmodus in de angiogeneseanalysator voor afbeelding J.Valideer vervolgens de kwantificeringsresultaten door de overlays van de herkende structuren en de originele afbeeldingen te onderzoeken. Pas voorbewerkingsparameters aan, analyseer originele afbeeldingen opnieuw of sluit problematische gebieden uit als het algoritme kunstmatige structuren detecteert met weinig of geen cellen zichtbaar in de oorspronkelijke afbeelding.
Normaliseer ten slotte de verkregen waarden tot een oppervlakte van één vierkante millimeter door de waarden van elk monster te vermenigvuldigen met de verhouding van het geanalyseerde gebied tot één vierkante millimeter. Gekwantificeerde parameters van de GFP huvec-netwerken toonden aan dat de totale netwerklengte het hoogst was in aanwezigheid van FGF-2 en het laagst in afwezigheid van groeifactoren. Het aantal knooppunten dat vertakkingspunten in de netwerken aangeeft, volgde dezelfde trend als de totale lengte.
Omgekeerd vertoonden beide groeifactoren significant minder geïsoleerde segmenten die wijzen op een hogere interconnectiviteit dan de aandoening zonder enige groeifactor.