Après avoir établi la co-culture de cellules endothéliales stromales, acquérir le signal GFP du huvec GFP en utilisant la microscopie à fluorescence avec des paramètres appropriés pour la quantification. Pré-traitez toutes les images acquises le même jour pour améliorer encore le contraste. Si vous utilisez Fidji ou l’image J, ouvrez toutes les images de canal GFP améliorées au même moment et ouvrez le menu luminosité et contraste.
Sélectionnez une image représentant une condition intermédiaire et ajustez automatiquement le contraste en sélectionnant auto. Cliquez sur Définir et cochez Propager à toutes les autres images ouvertes. Évaluez visuellement si la plage sélectionnée automatiquement correspond à toutes les images du point temporel actuel.
Si nécessaire, réajustez et repropagez manuellement la plage à toutes les images et enregistrez les images ajustées en tant que fichiers TIFF. Ensuite, appliquez un filtre de flou médian à toutes les images. Réduisez la taille en les classant et enregistrez-les en tant que fichiers TIFF couleur RVB en niveaux de gris dans un dossier pour la quantification.
Cela peut être fait manuellement ou en mode batch à l’aide de macros. Analyser toutes les images créées en utilisant le mode de traitement par lots dans l’analyseur d’angiogenèse pour l’image J.Puis valider les résultats de quantification en examinant les superpositions des structures reconnues et les images originales. Ajustez les paramètres de prétraitement, réanalysez les images originales ou excluez les zones problématiques si l’algorithme détecte des structures artificielles avec peu ou pas de cellules visibles dans l’image d’origine.
Enfin, normaliser les valeurs obtenues à une surface d’un millimètre carré en multipliant les valeurs de chaque échantillon par le rapport de la surface analysée à un millimètre carré. Les paramètres quantifiés des réseaux huvecs GFP ont montré que la longueur totale du réseau était la plus élevée en présence de FGF-2 et la plus faible en l’absence de facteurs de croissance. Le nombre de jonctions indiquant des embranchements dans les réseaux a suivi la même tendance que la longueur totale.
À l’inverse, les deux facteurs de croissance comportaient beaucoup moins de segments isolés, ce qui indique une interconnectivité plus élevée que la condition sans facteur de croissance.
