Quantifying the Endothelial Cell Network Formation After the 3D Stromal-Endothelial Cell Co-Culture

לאחר ביסוס תרבית תאי אנדותל סטרומה, לרכוש את אות GFP מן GFP huvec באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם הגדרות מתאימות לכימות. עבד מראש את כל התמונות שנרכשו באותו יום כדי לשפר עוד יותר את הניגודיות. אם אתם משתמשים בפיג'י או בתמונה J, פתחו את כל התמונות המשופרות בערוץ GFP בו-זמנית ופתחו את תפריט הבהירות והניגודיות.

בחרו תמונה המייצגת תנאי ביניים והתאימו אוטומטית את הניגודיות באמצעות בחירה באפשרות 'אוטומטי'. לחץ על הגדר וסמן את ההפצה לכל התמונות הפתוחות האחרות. הערך חזותית אם הטווח שנבחר אוטומטית מתאים לכל התמונות של נקודת הזמן הנוכחית.

במידת הצורך, התאימו ידנית והפיצו מחדש את הטווח לכל התמונות ושמרו את התמונות המותאמות כקובצי TIFF. לאחר מכן, החילו מסנן טשטוש חציוני על כל התמונות. הקטן את הגודל על-ידי כריכה ושמור אותם כקובצי TIFF בצבע RGB בקנה מידה אפור בתיקייה לצורך כימות.

ניתן לעשות זאת באופן ידני או במצב אצווה באמצעות פקודות מאקרו. נתח את כל התמונות שנוצרו באמצעות מצב תהליך אצווה במנתח אנגיוגנזה עבור תמונה J.לאחר מכן אמת את תוצאות הכימות על ידי בחינת שכבות העל של המבנים המוכרים והתמונות המקוריות. התאימו פרמטרים של עיבוד מראש, נתחו מחדש תמונות מקוריות או אל תכללו אזורים בעייתיים אם האלגוריתם מזהה מבנים מלאכותיים עם מעט תאים או ללא תאים גלויים כלל בתמונה המקורית.

לבסוף, לנרמל את הערכים המתקבלים לאזור של מילימטר מרובע אחד על ידי הכפלת הערכים של כל מדגם על ידי היחס בין השטח שניתח למילימטר מרובע אחד. פרמטרים מכומתים של רשתות GFP huvec הראו כי אורך הרשת הכולל היה הגבוה ביותר בנוכחות FGF-2 והנמוך ביותר בהיעדר גורמי צמיחה. מספר הצמתים המציינים נקודות הסתעפות ברשתות היה באותה מגמה כמו האורך הכולל.

לעומת זאת, שני גורמי הגדילה הציגו פחות מקטעים מבודדים באופן משמעותי המעידים על קישוריות גבוהה יותר מאשר המצב ללא גורם גדילה כלשהו.