Dopo aver stabilito la co-coltura di cellule endoteliali stromali, acquisire il segnale GFP dall'huvec GFP utilizzando la microscopia a fluorescenza con impostazioni adatte alla quantificazione. Pre-elaborare tutte le immagini acquisite nello stesso giorno per migliorare ulteriormente il contrasto. Se si utilizzano fiji o immagine J, aprire tutte le immagini del canale GFP avanzate contemporaneamente e aprire il menu di luminosità e contrasto.
Selezionate un'immagine che rappresenta una condizione intermedia e regolate automaticamente il contrasto selezionando auto. Fare clic su Imposta e selezionare Propaga a tutte le altre immagini aperte. Valuta visivamente se l'intervallo selezionato automaticamente si adatta a tutte le immagini del punto temporale corrente.
Se necessario, regolate e ripropagate manualmente l'intervallo a tutte le immagini e salvate le immagini modificate come file TIFF. Quindi, applica un filtro di sfocatura mediana a tutte le immagini. Riducete le dimensioni mediante binning e salvateli come file TIFF a colori RGB in scala di grigi in una cartella per la quantificazione.
Questo potrebbe essere fatto manualmente o in modalità batch utilizzando le macro. Analizzare tutte le immagini create utilizzando la modalità di elaborazione batch nell'analizzatore di angiogenesi per l'immagine J.Quindi convalidare i risultati della quantificazione esaminando le sovrapposizioni delle strutture riconosciute e le immagini originali. Regola i parametri di pre-elaborazione, rianalizza le immagini originali o escludi le aree problematiche se l'algoritmo rileva strutture artificiali con poche o nessuna cella visibile nell'immagine originale.
Infine normalizzare i valori ottenuti su un'area di un millimetro quadrato moltiplicando i valori di ciascun campione per il rapporto tra l'area analizzata e un millimetro quadrato. I parametri quantificati delle reti huvec GFP hanno mostrato che la lunghezza totale della rete era più alta in presenza di FGF-2 e più bassa in assenza di fattori di crescita. Il numero di giunzioni che indicano i punti di diramazione nelle reti ha seguito lo stesso andamento della lunghezza totale.
Al contrario, entrambi i fattori di crescita presentavano un numero significativamente inferiore di segmenti isolati che indicavano una maggiore interconnettività rispetto alla condizione senza alcun fattore di crescita.
