間質内皮細胞共培養を確立した後、定量に適した設定の蛍光顕微鏡を使用してGFP huvecからGFPシグナルを取得します。同じ日に取得したすべての画像を前処理して、コントラストをさらに高めます。フィジーまたは画像Jを使用している場合は、すべての拡張GFPチャネル画像を同じ時点で開き、明るさとコントラストメニューを開きます。
中間条件を表す画像を選択し、自動を選択してコントラストを自動調整します。[設定] をクリックし、[開いている他のすべての画像に反映する] をオンにします。自動的に選択された範囲が現在の時点のすべての画像に適合するかどうかを視覚的に評価します。
必要に応じて、範囲を手動で再調整してすべての画像に再伝播し、調整した画像をTIFFファイルとして保存します。次に、すべての画像にメディアンぼかしフィルターを適用します。ビニングしてサイズを縮小し、定量化のためにグレースケールRGBカラーTIFFファイルとしてフォルダーに保存します。
これは、手動で行うことも、マクロを使用してバッチ モードで実行することもできます。作成したすべての画像を血管新生分析装置のバッチ処理モードを使用して画像J.次に、認識された構造と元の画像のオーバーレイを調べることにより、定量化結果を検証します。前処理パラメータを調整したり、元の画像を再分析したり、アルゴリズムが元の画像に見える細胞がほとんどまたはまったくない人工構造を検出した場合は、問題のある領域を除外します。
最後に、各サンプルの値に分析された面積と1平方ミリメートルの比率を掛けることにより、得られた値を1平方ミリメートルの面積に正規化します。GFP huvecネットワークの定量化されたパラメータは、全ネットワーク長がFGF-2の存在下で最も高く、成長因子がない場合で最も低いことを示した。ネットワーク内の分岐点を示すジャンクションの数は、全長と同じ傾向をたどりました。
逆に、両方の成長因子は、成長因子のない条件よりも高い相互接続性を示す有意に少ない孤立セグメントを特徴としていました。
