Etter å ha etablert den stromale endotelcelle-kokulturen, må du skaffe GFP-signalet fra GFP-huvec ved hjelp av fluorescensmikroskopi med innstillinger som er egnet for kvantifisering. Forhåndsbehandle alle bildene som er anskaffet samme dag for å forbedre kontrasten ytterligere. Hvis du bruker fiji eller bilde J, åpner du alle de forbedrede GFP-kanalbildene samtidig og åpner lysstyrke- og kontrastmenyen.
Velg et bilde som representerer en mellomliggende tilstand, og juster kontrasten automatisk ved å velge auto. Klikk på sett og merk av for alle andre åpne bilder. Vurder visuelt om det automatisk valgte området passer til alle bildene i gjeldende tidsperiode.
Hvis det er nødvendig, må du manuelt justere og repropagere området til alle bildene og lagre de justerte bildene som TIFF-filer. Deretter bruker du et median uskarphetsfilter på alle bildene. Reduser størrelsen ved binning og lagre dem som TIFF-filer i gråtoner i en mappe for kvantifisering.
Dette kan gjøres manuelt eller i batch-modus ved hjelp av makroer. Analyser alle de opprettede bildene ved hjelp av batchprosessmodus i angiogeneseanalysatoren for bilde J.Valider deretter kvantifiseringsresultatene ved å undersøke overleggene til de anerkjente strukturer og originalbildene. Juster forhåndsbehandlingsparametere, analyser originalbilder på nytt eller utelat problematiske områder hvis algoritmen oppdager kunstige strukturer med få eller ingen celler synlige i originalbildet.
Til slutt normaliserer du de oppnådde verdiene til et område på en kvadratmillimeter ved å multiplisere verdiene for hver prøve med forholdet mellom det analyserte området og en kvadratmillimeter. Kvantifiserte parametere for GFP huvec-nettverkene viste at den totale nettverkslengden var høyest i nærvær av FGF-2 og lavest i fravær av vekstfaktorer. Antall knutepunkter som indikerer forgreningspunkter i nettene fulgte samme trend som den totale lengden.
Omvendt inneholdt begge vekstfaktorene betydelig færre isolerte segmenter som indikerer høyere sammenkobling enn tilstanden uten vekstfaktor.
